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鮑膿皰病熒光PCR檢測試劑盒說明書

2018年01月18日 11:06:56人氣:194來源:上海一研生物科技有限公司

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關(guān) 鍵 詞鮑膿皰病熒光PCR檢測試劑盒,elisa試劑盒
【資料簡介】

1、 鮑膿皰病熒光PCR檢測試劑盒簡介 
貨號:HB-913 
鮑膿皰病是由河流弧菌Ⅱ型引起,主要發(fā)生在貝類水產(chǎn)動物上。感染的病鮑表現(xiàn)出行動遲緩,
攝食量減少,腹足出現(xiàn)白色膿皰等癥狀并影響其附著力。該病在夏季高溫時極易爆發(fā),危害較大。
為了適應(yīng)鮑膿皰病快速檢測和疫病研究的需要,本公司總結(jié)相關(guān)研究報道并在其基礎(chǔ)上優(yōu)化改
進(jìn),開發(fā)了本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全操作簡單、
應(yīng)用廣泛和高通量檢測等特點及優(yōu)點。
2、試劑盒組成 
試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴(kuò)增試劑,具體組成參見表 1:
表 1:試劑盒組成(50test/盒)
組成成分 體積
樣品 DNA 提取液 1
樣品 DNA 提取液 2
5ml×1 管
500µl×1 管
核酸擴(kuò)增試劑: DEPC 水
鮑膿皰病熒光 PCR 反應(yīng)液
Taq 酶(5U/ul)
陰性對照
鮑膿皰病熒光陽性對照
5ml×1 管
750µl×1 管
40µl×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
*保存條件:樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。 
3、樣本采集,存放及運輸 
3.1 樣本采集:所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。
取組織標(biāo)記后置于離心管中,按照試劑盒配套的DNA 抽提試劑操作說明提取DNA模板。
3.2存放:研磨后的樣本在2 ℃-8 ℃條件下保存應(yīng)不超過24 h;-70 ℃以下可保存,但應(yīng)避免
反復(fù)凍融(zui多凍融3次)。
3.3 運輸:采用泡沫箱加冰密封進(jìn)行運輸。 
4、檢測步驟 
4.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進(jìn)行): 
4.1.1 取 n 個 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管,其中 n 為待檢樣品數(shù)和一管陰性對照之和,對每個管進(jìn)行
編號標(biāo)記。(注:試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板,無需提取核酸)
4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1,然后分別加入待測樣本和陰性對照各 100µl,一份樣本換用
一個吸頭;混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃~25℃條件下,12 000 r/min 離心 10 min。
4.1.3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀,再加入 10µl DNA 提取液 2,混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃~25℃
條件下,2 000 r/min 離心 10 s。
4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min;加入 90µl DEPC 水,12 000 r/min 離心 10 min,吸取上清,
即為提取的 DNA,冰上保存待用(提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存)。
4.2 熒光 PCR 檢測 
4.2.1 鮑膿皰病熒光PCR檢測試劑盒擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備(在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行):
從試劑盒中取出相應(yīng)的熒光 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶,2000×g 離心 5 秒鐘。每個樣品測試反應(yīng)體系
配制見下表 2。
表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表
試劑 熒光 PCR 反應(yīng)液 Taq 酶 合計
用量 14.5 μL 0.5μL 15μL
4.2.2 加樣(樣本處理區(qū)進(jìn)行):
向每個熒光 PCR 管孔中各分裝 15μL 的混合液,再分別加入樣本 DNA 模板 10μL,蓋緊管蓋,
500 r/min 離心 30 s。
4.2.3 PCR 檢測(在檢測區(qū)進(jìn)行):
循環(huán)條件設(shè)置:
*階段,95℃/5 sec;
第二階段,95℃/10 sec,60℃/20 sec,35 個循環(huán);在第二階段每次循環(huán)的退火延伸時收集熒光。試驗檢測結(jié)束后,根據(jù)收集的熒光曲線和 Ct 值判定結(jié)果。
5、結(jié)果判定 
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整,以閾值線剛好超過正常陰性樣
品擴(kuò)增曲線的zui高點為準(zhǔn)。
5.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
5.2.1 陰性對照無 Ct 值或無擴(kuò)增曲線。
5.2.2 陽性對照的 Ct 值應(yīng)<25.0,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。否則,此次實驗視為無效。
5.3 結(jié)果描述及判定
5.3.1 陰性:無Ct值或無擴(kuò)增曲線,示樣品中無鮑膿皰病核酸。
5.3.2 陽性:Ct值≤30,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,示樣品中存在鮑膿皰病核酸。
5.3.3 有效原則:Ct>30的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性,否則為陽性。
6、鮑膿皰病熒光PCR檢測試劑盒相關(guān)技術(shù)信息 
F:GACGCTTGGCAGTGTTCAAC
R:GTGCATTCCACCATATTTTCTTACG
Probe:5’-FAM-TGTCAGCACGCCAATCAATCACCCG-Eclipse-3’

 

上海一研生物科技有限公司作者

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