貝類(lèi)派琴蟲(chóng)屬感染PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

【資料簡(jiǎn)介】

1、 貝類(lèi)派琴蟲(chóng)屬感染PCR檢測(cè)試劑盒簡(jiǎn)介 
貨號(hào)：HB-911 
為了適應(yīng)貝類(lèi)派琴蟲(chóng)屬（Perkinsus genus）的快速檢測(cè)和疫病監(jiān)測(cè)的需要，本公司嚴(yán)格依據(jù)
2014 年 OIE 水生動(dòng)物疫病診斷手冊(cè)中規(guī)定的相應(yīng) PCR 檢測(cè)引物序列及其循環(huán)參數(shù)等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，在本
公司嚴(yán)謹(jǐn)?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量保證體系管控下和質(zhì)檢。確保本試劑盒滿(mǎn)足 OIE 中派琴蟲(chóng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求。
本試劑盒具有快速靈敏、特異、準(zhǔn)確 、安全、操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。
2、 試劑盒組成 
試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴(kuò)增試劑，具體組成參見(jiàn)表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體積 
核酸提取試劑： 樣品 DNA 提取液 1
 樣品 DNA 提取液 2
 5ml×1 管
500µl×1 管
核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水
派琴蟲(chóng)屬 PCR 反應(yīng)液
Taq 酶(5U/ul)
陰性對(duì)照
派琴蟲(chóng)屬 陽(yáng)性對(duì)照
 5ml×1 管
750µl×1 管
40µl×1 管
 1ml×1 管
 1ml×1 管
*保存條件：樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。 
3、 樣本采集，存放及運(yùn)輸 
3.1 樣本采集
所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干, 按照試劑盒配套的DNA 抽提試劑操作說(shuō)明提取DNA模
板。
3.2存放 
研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h；-70 ℃以下可保存，但應(yīng)避免反復(fù)
凍融（zui多凍融 3 次）。
3.3 運(yùn)輸 
采用泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。 
4、 檢測(cè)步驟 
4.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進(jìn)行)： 
4.1.1 貝類(lèi)派琴蟲(chóng)屬感染PCR檢測(cè)試劑盒取 n 個(gè) 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數(shù)和一管陰性對(duì)照之和，對(duì)每個(gè)管進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記。(注：試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照直接作為 PCR 檢測(cè)的模板，無(wú)需提取核酸)
4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分別加入待測(cè)樣本和陰性對(duì)照各 100µl，一份樣本換用
一個(gè)吸頭；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下，12 000 r/min 離心 10 min。
4.1.3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入 10µl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃條件下，2 000 r/min 離心 10 s。
4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清，即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）。
4.2 PCR 檢測(cè) 
4.2.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：
從試劑盒中取出 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶，2000×g 離心 5 秒鐘。每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見(jiàn)下表
2。
表 2 每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制表
試劑 PCR 反應(yīng)液 Taq 酶 合計(jì)
用量 14.5 μL 0.5μL 15μL
4.2.2 加樣（樣本處理區(qū)進(jìn)行）：
向每個(gè)PCR管中各分裝15μL的混合液，再分別加入樣本DNA模板10μL，蓋緊管蓋，500 r/min
離心 30 s。
4.2.3 PCR 檢測(cè)（在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行）：
循環(huán)條件設(shè)置：
*階段，95 o
C /4 min；
第二階段，95 o
C/1 min，55 o
C/1 min；72 o
C/1min; 40個(gè)循環(huán)；
第三階段，72 o
C/10 min;
第四階段，4 o
C 保存
4.3 瓊脂糖電泳
用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒(méi)膠
面。將10μL樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和相應(yīng)電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔。
在電泳時(shí)設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作對(duì)照。5 V/cm電泳約0.5 h，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止。在紫外燈下
或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增初預(yù)期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄。
5、 結(jié)果判定 
5.1 派琴蟲(chóng)屬的PCR后陽(yáng)性對(duì)照會(huì)出現(xiàn)一條703 bp的DNA片段。陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒(méi)有該核酸帶。
5.2 待測(cè)樣品 PCR 擴(kuò)增后能在相應(yīng) 703 bp DNA 位置上有帶，可判為派琴蟲(chóng)屬陽(yáng)性。
6、 相關(guān)技術(shù)信息 
6.1 貝類(lèi)派琴蟲(chóng)屬感染PCR檢測(cè)試劑盒引物序列
F：5’-CCG-CTTTGT-TTG-GAT-CCC-3’
R：5’-ACA-TCA-GGC-CTT-CTA-ATG-ATG-3