小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）原代培養(yǎng)實驗

【資料簡介】

實驗方法原理 
將小鼠的胚胎成纖維細胞（MEF）從機體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細胞，置MEF生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖。
實驗材料 孕鼠
試劑、試劑盒 PBSEDTA胰酶MEF生長培養(yǎng)基FBS高糖DMEM
儀器、耗材 眼科直剪眼科直鑷眼科彎鑷玻璃平皿3尼龍濾網(wǎng)離心管手術刀片
實驗步驟 
一、實驗材料準備

1.   動物
 
孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
 
2.   試劑
無Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生長培養(yǎng)基(高糖DMEM加10%FBS)。
 
3.  器械
 
眼科直剪3把、眼科直鑷3把、眼科彎鑷2把、玻璃平皿3套、200目尼龍濾網(wǎng)、50 ml和15 ml離心管和手術刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。

二、具體操作

1.  處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外一組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出子宮，后用第三組剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。
 
2.  用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS，再重復此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有D-PBS的平皿中，并用手術刀片將其細細切碎。
 
3.  用200 ul的移液槍反復、快速地吹打平皿中的液體，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，于4℃ 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。
 
4.   將上層細胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后，以1 500 rpm離心5分鐘收集細胞，再用30 ml MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。
 
5.  細胞沉淀用15 ml MEF生長培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù)(一般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。
 
6.   3x106細胞懸浮于15 ml MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。
 
7.  24小時后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。
 
8.  細胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時間不宜過長，作者一般不超過五分鐘)，按1:5傳代。
 
9.  細胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。

小鼠胚胎成纖維細胞(MEF 100倍)
收起
注意事項 
1.   原代培養(yǎng)，一定要避免污染。
 
2.   MEF生存能力有限，如果不凍存，體外存活十代左右。
 
3.  凍存后復蘇的細胞只能傳代一次，因為這些細胞繁殖能力有限。
 
4.  消化細胞時間不要過長。