甘油含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

【資料簡(jiǎn)介】

甘油含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

 

描述：甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物。脂蛋白酯酶能水解血液中的甘油三酯；胰脂酶可以水解食 物中的甘油三酯；激素敏感脂肪分解酶能水解脂肪細(xì)胞中的甘油三酯。與游離脂肪酸一樣，甘 油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測(cè)指標(biāo)，但檢測(cè)更方便。本試劑盒采用甘油氧化酶法 和經(jīng)典 GPO-Trinder 酶學(xué)反應(yīng)相結(jié)合的方法，通過(guò)比色法測(cè)定液體樣本中的甘油含量。經(jīng)過(guò)優(yōu) 化后，操作步驟更加簡(jiǎn)單，檢測(cè)線性范圍在 10-1200µmol/L，可靠性和重復(fù)性俱佳，適合生物 醫(yī)學(xué)、食品實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

1.Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.

2.Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 – 145

原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過(guò)氧 化氫；在過(guò)氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正比。

適用范圍：測(cè)定血液、細(xì)胞培養(yǎng)基、體液、酒類飲料中的甘油濃度。

組成 ：

R1 試劑 20 ml R2 試劑 5 ml

4 mmol/L 甘油標(biāo)準(zhǔn)品 1 ml

4 ºC，儲(chǔ)存6 個(gè)月。

所需設(shè)備：酶標(biāo)儀、生化分析儀或 721、722 型可見(jiàn)光分光光度計(jì)。佳工作波長(zhǎng) 550nm，如 無(wú)此波長(zhǎng)建議優(yōu)先選用 570nm、次選 530、490nm。

操作步驟：

一、樣本處理：

1、 酒類、飲品、清澈液體樣本：可直接進(jìn)行測(cè)定，如超過(guò)線性范圍可用蒸餾水或生理鹽水稀釋后 再測(cè)定。

2、培養(yǎng)液：取不含酚紅、無(wú)顏色、無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，如有細(xì)胞碎片應(yīng) 4ºC,，12,000g 離心 5min,取上清進(jìn)行測(cè)定。

3、血液：新鮮抗凝血，4ºC，2,000g 離心 5min 得到血漿；非抗凝血，先 4ºC 靜置 2h 得到血清后， 2000g 離心 10min,除去血細(xì)胞。將得到的血漿/血清 70ºC 加熱 10 分鐘滅活內(nèi)源脂肪酶，12,000g 離心 10min ,取上清測(cè)定或-20ºC 保存。

二 、工作溶液配制：按 4:1 比例，取 4 ml 試劑 R1 與 1 ml 試劑 R2 混合，立即使用或 4ºC 保存

<1 天，變色棄去。

三 、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體，將 4 mM 甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀 釋為 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L，通常取其中 4~6 管即可， 注意設(shè)置 0 濃度對(duì)照反應(yīng)管。

四、 甘油濃度測(cè)定： 

1、參見(jiàn)下表進(jìn)行加樣。為使反應(yīng)時(shí)間盡量一致，減小實(shí)驗(yàn)誤差，可先加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品，然后再加入工作溶液。（注意：當(dāng)甘油濃度較低時(shí)，可將待測(cè)樣品與工作溶液按照 100µl:100µl體積混合，然后再進(jìn)行測(cè)定，但是如果樣品體積超過(guò)100µl時(shí)將會(huì)稀釋工作液中酶的濃度，使反應(yīng)靈敏度下降。如果待測(cè)樣品濃度超過(guò)線性范圍，可進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后根據(jù)稀釋倍數(shù)來(lái)計(jì)算樣品中甘油濃度。）

2、37ºC 或 25ºC 反應(yīng) 15 分鐘。反應(yīng)平衡后顏色在 60 分鐘定。 3、先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零，然后測(cè)定各管 OD 值。

4、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算甘油濃度。

附 Excel 作圖步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管 OD 值為 y 軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 x 軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊做圖向?qū)?，選擇-散點(diǎn)圖-，點(diǎn)擊-完成-。(2)鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一點(diǎn)，點(diǎn)擊-添加趨勢(shì)線-，點(diǎn)擊-選項(xiàng)-，點(diǎn)擊-顯示公式-和-R2 值-。

 

表一：

酶標(biāo)微板測(cè)定的加樣比例（檢測(cè)范圍  10-1200µmol/L）

（可對(duì)樣品和工作液比例進(jìn)行微量調(diào)整）

	低濃度甘油樣品測(cè) 定			高濃度甘油樣品測(cè)定
	空白管	標(biāo)準(zhǔn)品	樣本管	空白管	標(biāo)準(zhǔn)品	樣本管
蒸餾水µl	50			5
標(biāo)準(zhǔn)品µl		50			5
樣品µl			50			5
工作液µl	150	150	150	195	195	195

 

 

表二：

1 ml 比色杯測(cè)定的加樣比例（檢測(cè)范圍 10-1200µmol/L）

	低濃度甘油樣品測(cè) 定			高濃度甘油樣品測(cè)定
	空白管	標(biāo)準(zhǔn)品	樣本管	空白管	標(biāo)準(zhǔn)品	樣本管
蒸餾水µl	200			50
標(biāo)準(zhǔn)品µl		200			50
樣品µl			200			50
工作液µl	600	600	600	750	750	750

 

說(shuō)明：

1、維生素  C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度  EDTA干擾測(cè)試。

2、正常血清甘油濃度為20-130µmol/L，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)須用不含酚紅的無(wú)色無(wú)血清培養(yǎng)基，如果 培養(yǎng)基中含有酚紅，可以選擇含有酚紅的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基作為對(duì)照進(jìn)行測(cè)定。