PCR法DNA探針標(biāo)記試劑盒使用說明書

【資料簡介】

 PCR法DNA探針標(biāo)記試劑盒

PCR DNA Probe Labeling Kit

原理及特點(diǎn)PCR標(biāo)記的原理是用帶標(biāo)記的dNTP進(jìn)行PCR，zui后得到的PCR產(chǎn)物將帶有標(biāo)記，可以直接用于雜交試驗(yàn)。其原理示意圖如下：

PCR法制備DNA探針示意圖

 

本產(chǎn)品在上述原理的基礎(chǔ)上本產(chǎn)品的特點(diǎn)是：

1.一站式，不需要自己單獨(dú)準(zhǔn)備標(biāo)記的核苷酸。

2.可用于各種同位素標(biāo)記和其他任何非同位素標(biāo)記（90604A，但需自備標(biāo)記底物，底物包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP）、其中90604B和90604C可直接用于*和地高辛標(biāo)記，不需自備標(biāo)記底物。

3.本試劑盒提供的dNTP中，標(biāo)記和非標(biāo)記dNTP的比例經(jīng)過優(yōu)化，不需要自己摸索。本產(chǎn)品得到的探針參入率一般為4-5%（每100個(gè)核苷酸中有4-5個(gè)將帶有非同位素標(biāo)記）。

4.如果使用非同位素標(biāo)記，得到的DNA探針將非常穩(wěn)定，可低溫長期放置。

5.可以用于Southern 和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等分析。

規(guī)格及成分成份5次塑料袋包裝

PCR Buffer 10×

（含15 mM MgCl2）50 uL

Taq DNA 聚合酶（5U/uL）25 uL

MgCl2（25 mM）50 uL

dATP、dTTP、dTP、dGTP各5 uL,共四管

標(biāo)記dNTP（含Biotin-11-dUTP）5 uL （B和C型有）

對照引物混合物（10 uM）10 uL

對照模板DNA5 uL

超純水1 mL

使用手冊1份

注：A型用于同位素標(biāo)記或自選標(biāo)記，四種dNTP每種5 uL，分開提供，每種濃度為2 mM；B型提供含Biotin-11-dUTP的dNTP混合物，用于*標(biāo)記；C型提供含DIG-dUTP的dNTP混合物，用于地高辛標(biāo)記。

 

運(yùn)輸及保存低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年

自備試劑DNA模板和模板專一性引物。

使用方法一：優(yōu)化PCR條件

1.設(shè)計(jì)引物時(shí)，使PCR產(chǎn)物的長度在300-2000 bp之間。過短則標(biāo)記參入少，探針雜交信號強(qiáng)度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強(qiáng)。

2.由于用戶的探針各不相同，所以需要用戶先自行優(yōu)化PCR條件，不能有非特異擴(kuò)增，因?yàn)闃?biāo)記的非特異擴(kuò)增產(chǎn)物會引起雜交后檢測時(shí)的高背景甚至假陽性。一旦優(yōu)化，請不要更改PCR參數(shù)和任何成分（用哪個(gè)批次做優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，就用同一批次做標(biāo)記實(shí)驗(yàn)）。本試劑盒提供的Taq DNA聚合酶和PCR Buffer、MgCl2足夠45次10 uL的優(yōu)化反應(yīng)和5次10 uL的標(biāo)記反應(yīng)用，但優(yōu)化用的dNTP需要自備。

3.雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈，但雜交時(shí)它們彼此還會復(fù)性，與探針與靶片段的結(jié)合反應(yīng)相競爭，降低檢測效率。因此為進(jìn)一步提高探針檢測靈敏度，用于單基因檢測等試驗(yàn)，強(qiáng)烈建議通過控制兩條引物的比例來實(shí)現(xiàn)單鏈PCR，制備高靈敏度的單鏈DNA探針。單鏈PCR條件也需要優(yōu)化，一旦優(yōu)化，請不要更改PCR參數(shù)和任何成分（用哪個(gè)批次做優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，就用同一批次做標(biāo)記實(shí)驗(yàn)）。

4.回收非標(biāo)記PCR產(chǎn)物作為電泳對照。

二：探針標(biāo)記及電泳檢測

1.按下表設(shè)置一個(gè)10 uL的標(biāo)記反應(yīng)體系。

成份用量

PCR Buffer, 10×1 uL

標(biāo)記dNTP（見注）1 uL

模板專一性引物一（自備）1 uL（10 uM）

模板專一性引物二（自備）1 uL（10 uM）

模板DNA（自備、總量不超過1 ug）1 uL

Taq DNA聚合酶（5U/uL）1 uL

超純水補(bǔ)到10 uL

2.用*步優(yōu)化的PCR參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記PCR。

3.取標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物1 uL，在瓊脂糖凝膠上電泳,用回收的非標(biāo)記PCR產(chǎn)物（同樣的引物和模板擴(kuò)增得到，只是沒標(biāo)記）。由于標(biāo)記反應(yīng)的PCR產(chǎn)物中有非同位素的參入、因此泳動速度將慢于非標(biāo)記PCR產(chǎn)物（但同位素標(biāo)記不能用此法）。下圖是一個(gè)典型的電泳結(jié)果圖：

 

標(biāo)記的DNA（右）與未標(biāo)記的DNA（左）電泳比較

4.剩余的標(biāo)記產(chǎn)物可以不經(jīng)過純化，直接加熱變性后加入（對雙鏈探針）或直接加入（對單鏈探針）雜交液中使用或者放-20℃長期保存。

5.如果要準(zhǔn)確檢測標(biāo)記效率（一般不必），取標(biāo)記產(chǎn)物1μL和DIG標(biāo)記的對照DNA（另售），用DNA稀釋液（另售）按10倍系列稀釋后點(diǎn)樣于帶正電荷尼龍膜上。用紫外交聯(lián)儀或真空烘烤固定DNA探針，按DIG雜交檢測試劑盒的方法進(jìn)行信號檢測，然后與膜條上的DIG標(biāo)記的對照DNA信號強(qiáng)度對比，推算出標(biāo)記的探針濃度。如初始模板量較大，可取1 μL標(biāo)記產(chǎn)物稀釋10~100倍后定。

6.如果有必要，可以用本試劑盒提供的對照模板和對照引物做按下表做對照標(biāo)記PCR反應(yīng)，所得產(chǎn)物長度為3000 bp：

程序名稱參數(shù)

預(yù)變性94℃ 4min 

PCR

（30個(gè)循環(huán)）94℃ 1 min

55℃ 1 min

72℃ 3 min

延伸72℃ 5 min

 

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品隨機(jī)引物法DNA探針標(biāo)記試劑盒（CAT#：90603）