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PCR法DNA探針標(biāo)記試劑盒使用說(shuō)明書
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PCR法DNA探針標(biāo)記試劑盒
PCR DNA Probe Labeling Kit原理及特點(diǎn)PCR標(biāo)記的原理是用帶標(biāo)記的dNTP進(jìn)行PCR,zui后得到的PCR產(chǎn)物將帶有標(biāo)記,可以直接用于雜交試驗(yàn)。其原理示意圖如下:PCR法制備DNA探針示意圖本產(chǎn)品在上述原理的基礎(chǔ)上本產(chǎn)品的特點(diǎn)是:1.一站式,不需要自己?jiǎn)为?dú)準(zhǔn)備標(biāo)記的核苷酸。2.可用于各種同位素標(biāo)記和其他任何非同位素標(biāo)記(90604A,但需自備標(biāo)記底物,底物包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP)、其中90604B和90604C可直接用于*和地高辛標(biāo)記,不需自備標(biāo)記底物。3.本試劑盒提供的dNTP中,標(biāo)記和非標(biāo)記dNTP的比例經(jīng)過(guò)優(yōu)化,不需要自己摸索。本產(chǎn)品得到的探針參入率一般為4-5%(每100個(gè)核苷酸中有4-5個(gè)將帶有非同位素標(biāo)記)。4.如果使用非同位素標(biāo)記,得到的DNA探針將非常穩(wěn)定,可低溫長(zhǎng)期放置。5.可以用于Southern 和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等分析。規(guī)格及成分成份5次塑料袋包裝PCR Buffer 10×(含15 mM MgCl2)50 uLTaq DNA 聚合酶(5U/uL)25 uLMgCl2(25 mM)50 uLdATP、dTTP、dTP、dGTP各5 uL,共四管標(biāo)記dNTP(含Biotin-11-dUTP)5 uL (B和C型有)對(duì)照引物混合物(10 uM)10 uL對(duì)照模板DNA5 uL超純水1 mL使用手冊(cè)1份注:A型用于同位素標(biāo)記或自選標(biāo)記,四種dNTP每種5 uL,分開(kāi)提供,每種濃度為2 mM;B型提供含Biotin-11-dUTP的dNTP混合物,用于*標(biāo)記;C型提供含DIG-dUTP的dNTP混合物,用于地高辛標(biāo)記。運(yùn)輸及保存低溫運(yùn)輸,-20℃保存,有效期一年自備試劑DNA模板和模板專一性引物。使用方法一:優(yōu)化PCR條件1.設(shè)計(jì)引物時(shí),使PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度在300-2000 bp之間。過(guò)短則標(biāo)記參入少,探針雜交信號(hào)強(qiáng)度減弱;過(guò)長(zhǎng)則非特異雜交增加,背景變強(qiáng)。2.由于用戶的探針各不相同,所以需要用戶先自行優(yōu)化PCR條件,不能有非特異擴(kuò)增,因?yàn)闃?biāo)記的非特異擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)引起雜交后檢測(cè)時(shí)的高背景甚至假陽(yáng)性。一旦優(yōu)化,請(qǐng)不要更改PCR參數(shù)和任何成分(用哪個(gè)批次做優(yōu)化實(shí)驗(yàn),就用同一批次做標(biāo)記實(shí)驗(yàn))。本試劑盒提供的Taq DNA聚合酶和PCR Buffer、MgCl2足夠45次10 uL的優(yōu)化反應(yīng)和5次10 uL的標(biāo)記反應(yīng)用,但優(yōu)化用的dNTP需要自備。3.雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈,但雜交時(shí)它們彼此還會(huì)復(fù)性,與探針與靶片段的結(jié)合反應(yīng)相競(jìng)爭(zhēng),降低檢測(cè)效率。因此為進(jìn)一步提高探針檢測(cè)靈敏度,用于單基因檢測(cè)等試驗(yàn),強(qiáng)烈建議通過(guò)控制兩條引物的比例來(lái)實(shí)現(xiàn)單鏈PCR,制備高靈敏度的單鏈DNA探針。單鏈PCR條件也需要優(yōu)化,一旦優(yōu)化,請(qǐng)不要更改PCR參數(shù)和任何成分(用哪個(gè)批次做優(yōu)化實(shí)驗(yàn),就用同一批次做標(biāo)記實(shí)驗(yàn))。4.回收非標(biāo)記PCR產(chǎn)物作為電泳對(duì)照。二:探針標(biāo)記及電泳檢測(cè)1.按下表設(shè)置一個(gè)10 uL的標(biāo)記反應(yīng)體系。成份用量PCR Buffer, 10×1 uL標(biāo)記dNTP(見(jiàn)注)1 uL模板專一性引物一(自備)1 uL(10 uM)模板專一性引物二(自備)1 uL(10 uM)模板DNA(自備、總量不超過(guò)1 ug)1 uLTaq DNA聚合酶(5U/uL)1 uL超純水補(bǔ)到10 uL2.用*步優(yōu)化的PCR參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記PCR。3.取標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物1 uL,在瓊脂糖凝膠上電泳,用回收的非標(biāo)記PCR產(chǎn)物(同樣的引物和模板擴(kuò)增得到,只是沒(méi)標(biāo)記)。由于標(biāo)記反應(yīng)的PCR產(chǎn)物中有非同位素的參入、因此泳動(dòng)速度將慢于非標(biāo)記PCR產(chǎn)物(但同位素標(biāo)記不能用此法)。下圖是一個(gè)典型的電泳結(jié)果圖:標(biāo)記的DNA(右)與未標(biāo)記的DNA(左)電泳比較4.剩余的標(biāo)記產(chǎn)物可以不經(jīng)過(guò)純化,直接加熱變性后加入(對(duì)雙鏈探針)或直接加入(對(duì)單鏈探針)雜交液中使用或者放-20℃長(zhǎng)期保存。5.如果要準(zhǔn)確檢測(cè)標(biāo)記效率(一般不必),取標(biāo)記產(chǎn)物1μL和DIG標(biāo)記的對(duì)照DNA(另售),用DNA稀釋液(另售)按10倍系列稀釋后點(diǎn)樣于帶正電荷尼龍膜上。用紫外交聯(lián)儀或真空烘烤固定DNA探針,按DIG雜交檢測(cè)試劑盒的方法進(jìn)行信號(hào)檢測(cè),然后與膜條上的DIG標(biāo)記的對(duì)照DNA信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比,推算出標(biāo)記的探針濃度。如初始模板量較大,可取1 μL標(biāo)記產(chǎn)物稀釋10~100倍后定。6.如果有必要,可以用本試劑盒提供的對(duì)照模板和對(duì)照引物做按下表做對(duì)照標(biāo)記PCR反應(yīng),所得產(chǎn)物長(zhǎng)度為3000 bp:程序名稱參數(shù)預(yù)變性94℃ 4minPCR(30個(gè)循環(huán))94℃ 1 min55℃ 1 min72℃ 3 min延伸72℃ 5 min關(guān)聯(lián)產(chǎn)品隨機(jī)引物法DNA探針標(biāo)記試劑盒(CAT#:90603)
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