技術(shù)講解：λ噬菌體DNA提取方法

【資料簡介】

λ噬菌體是zui早使用的克隆載體，λ噬菌體的基因組是一長度約為50kb的雙鏈DNA分子，它在宿主細(xì)胞有兩種生活途徑，其一是裂解生長，環(huán)狀DNA分子在細(xì)胞內(nèi)多次復(fù)制，合成大量噬菌體基因產(chǎn)物，裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌再進(jìn)行下一次感染;其二是溶源性生長，即感染細(xì)胞內(nèi)λ噬菌體DNA整合到宿主菌染色體DNA中與之一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不裂解。平板培養(yǎng)時(shí)，裂解生長形成噬斑。液體培養(yǎng)時(shí)，裂解生長使菌液中宿主菌zui后全部被裂解而釋放出大量的噬菌體顆粒。經(jīng)過改造的λ噬菌體克隆位點(diǎn)可插入幾到幾十kb的外源DNA。許多cDNA和基因組文庫是以λ噬菌體作為克隆載體構(gòu)建的。因此，在經(jīng)文庫篩選得到目的克隆后，我們常常需要利用λ噬菌體裂解生長的特點(diǎn)，培養(yǎng)獲得大量的噬菌體顆粒，并提取λ噬菌體DNA來開展進(jìn)一步的工作。

一、試劑準(zhǔn)備

1. LB液體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨（細(xì)菌培養(yǎng)用）10g，酵母提取物（細(xì)菌培養(yǎng)用）5g，NaCl 10g，加ddH2 O 至1000ml，*溶解，分裝小瓶，15lbf/in2高壓滅菌20min。

2. 1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基：稱取1.5g瓊脂粉放入300ml錐形瓶，加100mlLB，15 lbf/in2 高壓滅菌20min，稍冷卻，制備平皿。

3. 20%麥芽糖：麥芽糖20g，加ddH2O 至100ml，0.22μm濾膜過濾。

4. SM液：NaCl 5.8g，MgSO4·7H2O 2g，1M Tris·CL（PH7.5）50ml，2%明膠 5ml，加ddH2O 至1000ml。15lbf/in2高壓滅菌20min。

5. RNase A 10mg/ml，TE配制，沸水浴15min，分裝后貯存于-20℃。

6.DNase I 10mg/ml，TE配制，分裝后貯存于-20℃。

7. PEG 8000

8. 10%SDS

9.EDTA: 0.5M pH8.0

10. /氯仿/異戊醇（25：24：1）

11. 異丙醇

12. 無水乙醇、70%乙醇

二、操作步驟

1. λ噬菌體平板培養(yǎng)

① 用SM液10倍梯度稀釋λ噬菌體原種。

② 取0.1ml各梯度稀釋離心到一消毒微量離心管中，加0.2ml新鮮培養(yǎng)的宿主菌，加麥芽糖（0.2%），MgSO4（10mm），37℃溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于細(xì)菌。

③ 取熔化（47℃）0.7%瓊脂LB固體培養(yǎng)基3ml與上述管混勻，立即倒入預(yù)備（2-4天）的含凝固1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基的平板內(nèi)，輕輕晃動平板使均勻分布。

④ 37℃培養(yǎng)6-8hr后，觀察噬斑形成。

⑤ 用剪去部分頭部的吸頭挖取單個(gè)噬斑到0.5ml的SM液中，加0.05ml氯仿，震蕩。37℃溫育10min。

⑥ 重復(fù)⑴-⑷，獲得單個(gè)噬斑滴度。

2. λ噬菌體液體培養(yǎng)

① 取2ml新鮮培養(yǎng)的宿主菌，離心，0.4ml LB培養(yǎng)基重懸，加λ噬菌體0.1ml（新鮮獲得的單個(gè)噬斑，依滴度使之與宿主菌比約1/500-1000）。

② 加麥芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37℃溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于細(xì)菌。

③ 加到100ml LB液體培養(yǎng)基中，加麥芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37℃搖震培養(yǎng)9-12hr后可見裂解發(fā)生。

④ 加0.1ml氯仿，37℃繼續(xù)搖震培養(yǎng)10-20min。

二、λ噬菌體DNA提取

1. 將上述裂解液轉(zhuǎn)移至離心管，離心8000g×10min，去細(xì)菌碎片，取上清液。

2. 加RNase A、DNaseI 至1μg/ml， 37℃溫育30min。

3. 加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，搖勻至溶解，冰浴1hr或4℃過夜。

4. 4℃離心10000g×20min，去上清液。

5. 加2ml SM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量離心管，加20μl 10%SDS，20μl 0.5M EDTA，68℃15min。

6. 加等體積/氯仿/異戊醇（25：24：1），混勻，離心12000g×5min，取上層液到一新微量離心管，加等體積氯仿/異戊醇（24：1），混勻，離心12000g×5min。

7. 取上層液到一新微量離心管，加等體積異丙醇，混勻，-20℃1hr，4℃離心12000g×10min，去上清液。

8.1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉淀室溫下晾干。

9. 沉淀溶于20μl TE，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、注意事項(xiàng)

1. 用于裂解的噬菌體、宿主菌為新鮮培養(yǎng)獲得時(shí)，裂解好、裂解噬菌體收獲量大。

2. 液體培養(yǎng)裂解時(shí)，如到培養(yǎng)時(shí)間時(shí)裂解尚未發(fā)生，可適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度或加大搖震速度。

3. RNase A 、DnaseI消化不全，DNA、RNA可粘走部分噬菌體。

4. /氯仿抽提時(shí)，注意PEG、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染，它們會影響限制性內(nèi)切酶切割。