金魚(yú)Agouti相關(guān)蛋白（AGRP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

【資料簡(jiǎn)介】

 

金魚(yú)Agouti相關(guān)蛋白（AGRP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

本試劑盒僅供研究使用。

檢測(cè)范圍： 96T

1.5ng/L -40 ng/L

使用目的：

本試劑盒用于測(cè)定金魚(yú)血清、血漿及相關(guān)液體樣本中 Agouti 相關(guān)蛋白（AGRP）含量。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中金魚(yú) Agouti 相關(guān)蛋白（AGRP）水平。用純化的金魚(yú) Agouti 相關(guān)蛋白（AGRP）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入 Agouti 相關(guān)蛋白（AGRP），再與 HRP 標(biāo)記的 Agouti 相關(guān)蛋白（AGRP）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 Agouti 相關(guān)蛋白（AGRP）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中金魚(yú) Agouti 相關(guān)蛋白（AGRP）濃度。

試劑盒組成

1

30 倍濃縮洗滌液

20ml×1 瓶

7

終止液

6ml×1 瓶

2

酶標(biāo)試劑

6ml×1 瓶

8

標(biāo)準(zhǔn)品（80ng/L）

0.5ml×1 瓶

3

酶標(biāo)包被板

12 孔×8 條

9

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

1.5ml×1 瓶

4

樣品稀釋液

6ml×1 瓶

10

說(shuō)明書(shū)

1 份

5

顯色劑 A 液

6ml×1 瓶

11

封板膜

2 張

6

顯色劑 B 液

6ml×1/瓶

12

密封袋

1 個(gè)

標(biāo)本要求

1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測(cè)含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

40 ng/L

5 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

150µl 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

20 ng/L

4 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

150µl 的 5 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

10 ng/L

3 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

150µl 的 4 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

5.0 ng/L

2 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

150µl 的 3 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2.5 ng/L

1 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品

150µl 的 2 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50µl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40µl，然后再加待測(cè)樣品 10µl（樣品zui終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

4.配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50µl，空白孔除外。

7.溫育：操作同 3。

8.洗滌：操作同 5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑 A50µl，再加入顯色劑 B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 分鐘.

10. 終止：每孔加終止液 50µl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

操作程序總結(jié)：

計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4． 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本 OD 值

大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD 值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請(qǐng)避光保存。

7．嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6 個(gè)月