大鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）

【資料簡(jiǎn)介】

實(shí)驗(yàn)原理：

   本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）水平。用純化的大鼠白細(xì)胞介素6抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入白細(xì)胞介素6，再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-6呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）濃度。

 

 

試劑盒組成：

試劑盒組成	48孔配置	96孔配置	保存
說(shuō)明書	1份	1份
封板膜	2片（48）	2片（96）
密封袋	1個(gè)	1個(gè)
酶標(biāo)包被板	1×48	1×96	2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品：180ng/L	0.5ml×1瓶	0.5ml×1瓶	2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液	1.5ml×1瓶	1.5ml×1瓶	2-8℃保存
酶標(biāo)試劑	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
樣品稀釋液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑A液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑B液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
終止液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃保存
濃縮洗滌液	（20ml×20倍）×1瓶	（20ml×30倍）×1瓶	2

-8℃保存

 

 

樣本處理及要求：

 

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

 

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

 

3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

 

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2

-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃

保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

 

7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

 

操作步驟：

 

1.         標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在*、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為120 ng/L，80ng/L ，40 ng/L，20ng/L，10 ng/L）。

 

2.         加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.         溫育：用封板膜封板后置37℃

溫育30分鐘。

 

4.         配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。

 

5.         洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

 

6.         加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

 

7.         溫育：操作同3。

 

8.         洗滌：操作同5。

9.         顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃

避光顯色15分鐘.

 

10.     終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

 

11.     測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

 

注意事項(xiàng)：

 

1．  試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

 

2．  濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

 

3．  各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，使用排槍加樣。

 

4．  請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

 

5．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

 

6．  底物請(qǐng)避光保存。

 

7．  嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

 

8．  所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

 

9．  本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

10. 如與英文說(shuō)明書有異，以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)。

 

計(jì)算：

 

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，   

 

在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD     

 

值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋      

 

倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)      

 

準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值      

 

代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋      

 

倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。                  

 

 

 

                                             

 

 

（此圖僅供參考）

 

 

 

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990以上。

 

2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和11%

 

 

檢測(cè)范圍：                                             

 

8ng/L -150ng/L                                      

                           

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個(gè)月