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牛副流感病毒III型 (PIV-III)酶聯(lián)免疫分析 (ELISA)

2013年09月16日 09:17:35人氣:309來源:上海逸峰生物科技有限公司

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關(guān) 鍵 詞牛副流感病毒III型, (PIV-III),酶聯(lián)免疫分析,(ELISA)
【資料簡介】

牛副流感病毒III PIV-III酶聯(lián)免疫分析(ELISA)

試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用       目的:本試劑盒用于檢測牛血清,血漿及相關(guān)液體樣本中副流感病毒III型 (PIV-III)水平,感染人的血液學(xué)診斷。

實驗原理:

  本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定標(biāo)本中牛副流感病毒III型 (PIV-III)。用純化的牛副流感病毒III型 (PIV-III)抗體包被微孔板,制成固相抗體,可與樣品中副流感病毒III型 (PIV-III)相結(jié)合,經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標(biāo)記的副流感病毒III型 (PIV-III)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),與CUTOFF值相比較,從而判定標(biāo)本中牛副流感病毒III型 (PIV-III)的存在與否。

 

試劑盒組成

試劑盒組成

48孔配置

96孔配置

保存

說明書

1份

1份

 

封板膜

2片(48)

2片(96)

 

密封袋

1個

1個

 

酶標(biāo)包被板

1×48

1×96

2-8℃保存

陰性對照

0.5ml×1瓶

0.5ml×1瓶

2-8℃保存

陽性對照

0.5ml×1瓶

0.5ml×1瓶

2-8℃保存

酶標(biāo)試劑

3 ml×1瓶

6 ml×1瓶

2-8℃保存

樣品稀釋液

3 ml×1瓶

6 ml×1瓶

2-8℃保存

顯色劑A液

3 ml×1瓶

6 ml×1瓶

2-8℃保存

顯色劑B液

3 ml×1瓶

6 ml×1瓶

2-8℃保存

終止液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃保存

濃縮洗滌液

(20ml×20倍)×1瓶

(20ml×30倍)×1瓶

2-8℃保存

 

樣本處理及要求

1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。

3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

5. 組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

6. 標(biāo)本采集后盡早進行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進行,提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

 

操作步驟:

  1. 編號:將樣品對應(yīng)微孔按序編號,每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)
  2. 加樣:分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,
  3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。 
  4. 配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用
  5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。
  6. 加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。
  7. 溫育:操作同3。
  8. 洗滌:操作同5。
  9. 顯色:每孔先加入顯色劑A 50μl,再加入顯色劑B 50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘
  10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
  11. 測定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

 

結(jié)果判定:

  試驗有效性:陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10

  臨界值(CUT OFF)計算:臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

  陰性判定:樣品OD值< 臨界值(CUT OFF)者為副流感病毒III型 (PIV-III)陰性

  陽性判定:樣品OD值≥ 臨界值(CUT OFF)者為副流感病毒III型 (PIV-III)陽性

注意事項

1.操作嚴(yán)格按照說明書進行,本試劑不同批號組分不得混用。

2.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

3.濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結(jié)果。

  1. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

5.底物請避光保存。

6.試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),使用雙波長檢測時,參考波長為630nm

7.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸,使用時必須注意安全。

 

保存條件及有效期

1.試劑盒保存:;2-8℃。

2.有效期:6個月

 

上海逸峰生物科技有限公司作者

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