單向免疫擴(kuò)散法（Single radil immunodiffusion）—正常人群IgG正常值檢

【資料簡介】

【原理】
在含有特異抗體的瓊脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，當(dāng)抗原向周圍擴(kuò)散后與瓊脂中抗體相結(jié)合，既形成白色沉淀環(huán)，其直徑或面積與抗原濃度呈正相關(guān)。同時用標(biāo)準(zhǔn)抗原或參考蛋白制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可用以定量檢測未知標(biāo)本的抗原濃度（mg/ml或IU/ml）。
應(yīng)用這一實驗方法可檢測正常人群或患者血清中IgG、IgA及IgM的含量及正常值。
【材料】
1．示教部分：
2%離子瓊脂或生理鹽水瓊脂（內(nèi)含2‰NaN3）
標(biāo)準(zhǔn)馬抗人IgG血清（抗體）（北京生物制品研究所生產(chǎn)）
參考蛋白工作標(biāo)準(zhǔn)（北京生物制品研究所生產(chǎn)）
pH7.2 PBS
玻璃板或載玻片。
打孔器（孔徑3mm）及打孔模板。
微量加樣器
濕盒（容器內(nèi)加濕紗布或泡沫塑料）
2．實驗部分：
已制備好的含有馬抗人IgG抗體的1%瓊脂板。
1:50稀釋的單人份待檢血清標(biāo)本。
打孔器、模板、微量加樣器及濕盒等。
【方法】
（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：示教
1．按照玻片的大小，以能制做1~1.5mm厚度的瓊脂板的量，分裝其1/2量的2%鹽水瓊脂。例如，用普通載玻片制做時其1%瓊脂量為4ml，在分裝2%鹽水瓊脂時既為2ml。溶化后置56~60℃水浴中平衡溫度備用。
2．稀釋抗體：將標(biāo)準(zhǔn)抗人IgG抗體按其效價用pH7.2 PBS做成1倍稀釋。例如，血清效價為1:140，原濃血清既應(yīng)稀釋為1:70。并分裝試管，其分裝量應(yīng)與2%鹽水瓊脂量相等。
3．制板：將已稀釋的抗人IgG抗體于56℃水浴中預(yù)熱約半分鐘，再傾注于已溶化并維持56~60℃的2%鹽水瓊脂管中，用拇指將管口堵緊。翻轉(zhuǎn)試管1~2次，將抗體與瓊脂混合均勻（注意：抗體與瓊脂混合時切勿產(chǎn)生氣泡），迅速傾注于玻片上，待凝固后既制成。
4．打孔：將瓊脂板置于模板上，在同一直線上用打孔器打孔5個，孔距10mm。
5．稀釋不同濃度的參考蛋白標(biāo)準(zhǔn)（工作標(biāo)準(zhǔn)）：應(yīng)根據(jù)制品說明進(jìn)行稀釋，例如：工作標(biāo)準(zhǔn)中免疫球蛋白含量，IgG為100單位/ml，80.4微克/單位，其稀釋范圍為1:10、1:20、1:40、1:80及1:160。
6．加樣：將已稀釋的不同濃度的工作標(biāo)準(zhǔn)順序用微量加樣器每孔加入10μl（注意：每一稀釋度均應(yīng)更換塑料吸頭）。
7．置濕盒中，放37℃溫箱，24小時后觀察結(jié)果。
8．用量角規(guī)測量并記錄沉淀環(huán)直徑，然后以沉淀環(huán)直徑為縱座標(biāo)，不同單位/ml為橫座標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在制做標(biāo)準(zhǔn)曲線時，為盡量減少誤差，至少應(yīng)做兩份以上標(biāo)準(zhǔn)板。
（二）正常人血清中IgG值的測定：
1．將已制備好的抗體瓊脂板置打孔模板上，每一瓊脂板可打孔4個（孔徑3mm，孔距10mm）。
2．將單份正常人血清用pH7.2 PBS分別作1:50稀釋。
3．用微量加樣器分別取1:50稀釋的單人份血清標(biāo)本10μl加入孔中，每份標(biāo)本應(yīng)各加兩孔（每份標(biāo)本均應(yīng)更換塑料吸頭）。
4．作好標(biāo)記置濕盒中，放37℃溫箱，24小時后觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
測量各份標(biāo)本的沉淀環(huán)直徑并記錄結(jié)果，然后用標(biāo)準(zhǔn)曲線測出每份標(biāo)本所含IgG的單位/ml，并換算為mg/ml。
將全班實驗結(jié)果做出統(tǒng)計及均值，并寫出較完整的實驗報告。