士鋒生物淀粉酶活性的測定

【資料簡介】

一、原理
（amylase）包括幾種催化特點(diǎn)不同的成員，其中α－隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時(shí)使淀粉漿的粘度下降，因此又稱為液化酶；β－每次從淀粉的非還端切下一分子麥芽糖，又被稱為糖化酶；葡萄糖則從淀粉的非還原端每次切下一個(gè)葡萄糖。產(chǎn)生的這些還原糖能使3，5－二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3－氨基－5－硝基水楊酸?；盍Φ拇笮∨c產(chǎn)生的還原糖的量成正比。可以用麥芽糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用比色法測定淀粉生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的還原糖的量表示酶活力。幾乎所有植物中都存在有，特別是萌發(fā)后的禾谷類種子活性zui強(qiáng)，主要是α－和β－。Α－不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化；而β－不耐熱，在70℃15min則被鈍化。根據(jù)它們的這種特性，在測定時(shí)鈍化其中之一，就可測出另一個(gè)的活力。本實(shí)驗(yàn)采用加熱鈍化β－測出α－的活力，再與非鈍化條件下測定的總活力（α＋β）比較，求出β－的活力。

二、材料、儀器設(shè)備及試劑
（一）材料：萌發(fā)的小麥種子（芽長約1cm）。
（二）儀器設(shè)備：1. 分光光度計(jì)；2. 離心機(jī)；3. 恒溫水?。?7℃，70℃，100℃）；4.具塞刻度試管；5. 刻度吸管；6. 容量瓶。
（三）試劑（均為分析純）：1. 標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（1mg/ml）：稱取100mg麥芽糖，用蒸餾水溶解并定容至100ml；2. 3，5－二硝基水楊酸試劑：稱取1g3，5－二硝基水楊酸，溶于20ml2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100ml。蓋緊瓶塞，勿使CO2進(jìn)入。若溶液混濁可過濾后使用；3.01mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液：A液（0.1mol/L 檸檬酸）：稱取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸餾水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L 檸檬酸鈉）：稱取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸餾水溶解并定容至1L。取A液55ml與B液145ml混勻，即為0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液；4.1％淀粉溶液：稱取1g淀粉溶于100ml0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液中。

三、實(shí)驗(yàn)步驟
（一）麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取7支干凈的具塞刻度試管，編號，按表（詳教材）加入試劑。搖勻，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20ml。以1號管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在540nm波長下比色測定。以麥芽糖含量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.
（二）酶液制備：稱取1g萌發(fā)3天的小麥種子（芽長約1cm），置于研缽中，加少量石英砂和2ml蒸餾水，研磨成勻漿。將勻漿倒入離心管中，用6ml蒸餾水分次將殘?jiān)慈腚x心管。提取液在室溫下放置提取15～20min，每隔數(shù)min攪動(dòng)1次，使其充分提取。然后在3000rpm下離心10min，將上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為原液。吸取上述原液10ml，放入50ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為稀釋液。
（三）酶活力的測定：取6支干凈的具塞刻度試管，編號，按表（詳教材）進(jìn)行操作。 
（四）結(jié)果計(jì)算：活力=C×VT/(W×Vs×T)(mg/g/min)。式中，C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的麥芽糖含量（mg）；VT為原液總體積（ml）；Vs為反應(yīng)所用原液體積（ml）；W為樣品重量（g）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）。