RNA純化技術(shù)

【資料簡介】

RNA純化技術(shù)

“新技術(shù)發(fā)展賦予了RNA純化技術(shù)更高的質(zhì)量，更快的速度和更好的有效性”

一些基礎(chǔ)性的實驗室技術(shù)，比如Northern blot分析，RNA保護(hù)性實驗（RNA protection assays），原位雜交（in situ hybridization）和逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）等都需要高質(zhì)量，高純度的RNA樣品。但是做過RNA純化的人都知道，準(zhǔn)備這些樣品往往耗時耗力，這主要是因為那些“可惡”的即穩(wěn)定又到處可見的RNAses很容易就把這些樣品降解了。

以前這些RNA制備的工作往往都需要特定的實驗室，特殊的儀器，和一些專門從事這一方面的研究人員十分小心的操作完成，但是隨著生物技術(shù)的發(fā)展，許多RNA純化產(chǎn)品和操作手冊的出現(xiàn)，研究人員也逐漸可以輕松解決RNA純化問題，專注于自己的科學(xué)研究內(nèi)容了，即使是缺乏RNA操作專家的實驗室也能放心著手基因表達(dá)分析的研究了。

細(xì)胞裂解

RNA提取的*步是細(xì)胞裂解，這一步簡而言之就是要使組成細(xì)胞膜的蛋白變性。

1979年John Chirgwin和他的同事發(fā)明了一種可以不改變核苷酸而破裂細(xì)胞膜的方法：先將組織在異硫氰酸胍（Guanidine Thiocyanate）——一種蛋白變性劑和b-巰基乙醇——一種還原劑中混合均勻（胍基裂解法），然后通過乙醇抽提或者氯化銫梯度超速離心就可以分離純化細(xì)胞中的RNA了。這種技術(shù)是*種可以特異性分離RNA的方法，但是存在許多缺點，比如這種技術(shù)耗時長，低效率，也存在一定的危險性和不一致性。

1987年P(guān)iotr Chomczynski和Nicoletta Sacchi對這一技術(shù)進(jìn)行了改良，他們通過將異硫氰酸胍和酚/氯仿（phenol-chloroform）結(jié)合起來，將抽提的步驟縮短到了一步，這一修改至少帶來了兩個改進(jìn)：*，減少了RNA分離的時間，增加收集到的樣品數(shù)，二來就是減少了RNA的損失，增大了樣品選擇范圍，允許研究人員從更少量樣品數(shù)中純化RNA。然而盡管優(yōu)化了純化步驟，但是這種方法仍然有一些不足之處，比如說，超速離心不僅需要昂貴的設(shè)施，而且也經(jīng)常導(dǎo)致RNA凝集，形成pellets，不利于懸浮。而且粗糙的有機(jī)溶劑也會引起樣品中RNA斷裂，造成損失。

在進(jìn)一步完善這些方法的道路上，許多生物技術(shù)公司也貢獻(xiàn)不小，比如的RNA公司Ambion（現(xiàn)RNA部門已被ABI收購），旗下的ToTALLY RNA?總RNA提取試劑盒就是基于Chomczynski和Sacchi的異硫氰酸胍，酚:氯仿方法，這個試劑盒包含了這一方法所需的除異丙醇以外的所有試劑。通過Ambion的試劑整合和流水線操作，ToTALLY RNA?試劑盒可以從來源廣泛（包括植物組織到細(xì)菌在內(nèi)的許多來源），樣品量較低（10g組織或者109培養(yǎng)細(xì)胞）的條件下純化得到高質(zhì)量RNA。

另外一個倍受關(guān)注的，改進(jìn)了RNA分離提取方法的生物技術(shù)公司就是GE（原Amersham Biosciences）公司了，雖然GE采用的也是異硫氰酸胍方法，吸取了其中的優(yōu)點，但是他們的RNA提取試劑盒利用氯化鋰和三氟醋酸銫（cesium trifluoroacetate，CsTFA）進(jìn)行選擇性沉淀和密度離心，這樣就不用依賴于有機(jī)溶劑，可以用普通的離心機(jī)在60分鐘內(nèi)，從少至25mg或者106-108細(xì)胞樣品中分離得到RNA，而且CsTFA離心對于避免RNAses降解作用也有更高的保護(hù)作用。

近期GE又推出了一款新產(chǎn)品：RNAspin總RNA分離試劑盒，這一系列試劑盒采用了的硅膠膜離心柱，配合*的預(yù)過濾器和柱上 DNaseI 酶解等技術(shù)， 能確保每次實驗都能得到所需要的產(chǎn)率、純度和重復(fù)性，這一試劑盒就像是特別為敏感的下游應(yīng)用，例如定量RT-PCR 及微陣列分析而設(shè)計的一個RNA純化分離試劑盒。

除此之外，Maxim Biotech則提供了一種能從任何組織或者細(xì)胞類型的樣品中提取RNA的試劑盒：Gstract?總RNA分離試劑盒，這一試劑盒有一個*的附加提取步驟，能減少DNA和其它污染物的含量，因此得到的RNA可以直接用于一些譬如RT-PCR的實驗。還有PGC Scientifics公司的RNA NOW?，一種60分鐘內(nèi)從107細(xì)胞或者100mg組織中分離RNA的產(chǎn)品，這一試劑盒zui大的特點就是生物可降解性，是一種不需*的環(huán)保型試劑。另外Qbiogene Inc也推出了一種總RNA提取試劑盒：Safekit?，可以從10-100mg組織樣品中得到100ug總RNA。

離心分離

幾個公司已經(jīng)將胍基裂解法進(jìn)行改進(jìn)，利用RNA吸附硅膠和玻璃質(zhì)離心管代替了有機(jī)溶劑提取步驟。這些改良系統(tǒng)的主要優(yōu)點是：使用者可以避免有害的有機(jī)溶劑，例如，酚、三氯甲烷、異丙醇。根據(jù)不同的設(shè)計方式，離心柱RNA純化流程可以通過離心或者真空驅(qū)使細(xì)胞裂解物穿越濾膜。對于小量制備而言，生產(chǎn)商將濾膜安置在小型離心管中，即可簡化用戶的使用步驟。

QIAGEN的 RNeasy? Stabilization and Total RNA Isolation System 就是一種離心柱型RNA提取試劑盒系統(tǒng)。RNeasy系列試劑盒能從動物細(xì)胞、組織，植物，真菌細(xì)胞和組織中提取高質(zhì)量的RNA。使用RNeasy系統(tǒng)，研究人員們能在不使用酚/氯仿抽提、氯化銫梯度離心、或者氯化鋰或者乙醇沉淀的情況下30分鐘內(nèi)完成RNA樣品的收集。QIAGEN公司同時也提供了為動物組織設(shè)計的RNeasy Protect Kits、為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌設(shè)計的RNeasy Protect Bacteria Kits。這些試劑盒包含了RNAlater RNA穩(wěn)定試劑，這些試劑能穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的RNA情況，以便下游結(jié)果能準(zhǔn)確地反映制備時樣品RNA表達(dá)狀態(tài)。

另一家是QIAGEN和BD 生物科學(xué)公司合資經(jīng)營的品牌PreAnalytiX近幾年也推出了一款RNA純化試劑盒：PAXgene? Blood RNA System血液RNA提取系統(tǒng)，臨床研究人員可以利用該系統(tǒng)收集、儲存、穩(wěn)定和從全血細(xì)胞中分離RNA。抽血者將血液注入特定的PAXgene Blood RNA試管，這些試管內(nèi)含有穩(wěn)定RNA的試劑，能使血液樣品在室溫中穩(wěn)定保存5天。隨后，研究者可以利用PAXgene Blood RNA Kit試劑盒來分離RNA。像QIAGEN公司的RNeasy系列試劑盒一樣，也是通過離心柱純化RNA。

羅氏診斷公司應(yīng)用科學(xué)部的高純度RNA分離試劑盒（High Pure Plasmid Isolation Kit）利用玻璃纖維絨毛濾器安裝在離心管內(nèi)。該試劑盒利用單一的試劑裂解細(xì)胞，并失活RNAses。絨毛結(jié)合總RNA，通過DNAse 選擇性的處理除去DNA污染。根據(jù)羅氏公司的介紹，該試劑盒能大范圍用于全血和酵母細(xì)胞的RNA提取。能使研究人員在數(shù)分鐘的情況下純化幾種樣品的總RNA.

Stratagene公司也為研究人員提供Absoluy RNA RT-PCR Miniprep Kit試劑盒與Absoluy RNA Microprep kit試劑盒，前者能滿足用戶提取107細(xì)胞或者40mg組織RNA的要求，后者則可以用于5 x 105細(xì)胞RNA的提取，這對于激光微解剖樣品尤為適用。該公司還生產(chǎn)了一種StrataPrep?-96 Total RNA Purification Kit試劑盒，主要用于高通量RNA純化需要。該試劑盒允許研究人員在96孔板內(nèi)提取樣品RNA，能與普通的96孔板真空復(fù)合管和離心轉(zhuǎn)子兼容。

大部分RNA分離試劑盒需要利用新鮮的或者低溫凍存的組織作為起始提取材料。然而這些樣品不是立即就能獲得。為了解決這個問題，Zymo研發(fā)了Pinpoint Slide RNA Isolation System。這種系統(tǒng)使研究人員能輕易地在顯微鏡玻片上直接選擇目的區(qū)域進(jìn)行總RNA的提取�？茖W(xué)家們能通過Pinpoint Slide Isolation System I恢復(fù)經(jīng)固定后的新鮮程度和凍存的目的組織總RNA。利用Pinpoint Slide Isolation System II從選擇石蠟包被區(qū)域中純化RNA�？茖W(xué)家們因此可以檢測解剖學(xué)生稀有的組織的RNA情況和研究目的區(qū)域的RNA情況。

mRNA收集

通常，總RNA的分離只是mRNA純化的*步。zui普遍的mRNA分離依賴于與真核生物mRNA3'端poly（A）互補(bǔ)的含有20-30胸腺嘧啶的oligo[dT]序列。供應(yīng)商通常將oligo[dT]鏈通過5'的磷酸鍵與纖維素基質(zhì)連接。使用者可以通過其來分離純化mRNA。

Ambion公司提供了幾種Poly（A）Purist? mRNA Purification Kit試劑盒，這些試劑盒都是基于oligo[dT]-纖維素原理：Poly（A）Purist?、MicroPoly（A）Purist?小量mRNA純化試劑盒、和Poly（A）Purist Mag mRNA純化試劑盒。

GE（Amersham Biosciences）公司也提供了幾種利用oligo[dT]-纖維素柱子的mRNA純化試劑盒。據(jù)GE稱，這些mRNA純化試劑盒能在30-45分鐘內(nèi)從小量樣品的總RNA中純化出mRNA。該試劑盒包含了一種試劑，能減少核酸酶的污染風(fēng)險。

BD生物科學(xué)公司和CLONTECH公司同樣也提供了oligo[dT]- cellulose試劑盒。CLONTECH公司（現(xiàn)Takara公司）的NucleoTrap? mRNA Kit和QIAGEN公司的Oligotex? mRNA Purification System都利用了乳膠磁珠代替了纖維素與oligo[dT]共價連接。乳膠磁珠的球形表面能實現(xiàn)均一分布和zui小的離心時間，產(chǎn)生純化的mRNA。

盡管mRNA純化試劑盒依賴于總RNA提取作為*步。Amersham Biosciences 和 QIAGEN公司提供了能直接從動物組織和細(xì)胞。如：QIAGEN公司的Oligotex Direct mRNA System系統(tǒng)和Amersham Biosciences'公司的QuickPrep mRNA Purification 和 QuickPrep Micro mRNA Purification Kit試劑盒。

磁性分離

盡管oligo[dT]技術(shù)能夠增加mRNA的純度和產(chǎn)量。但是一些研究人員仍然覺得離心柱型試劑盒不便于使用。幸運的是，例如CPG, Ambion, 和 Roche等公司提供了一種基于磁性分離技術(shù)的mRNA分離試劑盒。

磁性分離技術(shù)能通過利用磁場在單一的管內(nèi)實現(xiàn)mRNA的純化，因此消除了液相操作過程中潛在樣品的損失。磁性分離技術(shù)依賴于用聚苯乙烯和氧化鐵加上多糖做成的超磁顆粒——這些顆粒僅磁場中磁化。

對于mRNA純化來說，磁珠通過包被這些顆粒的官能團(tuán)與oligo[dT]分子偶聯(lián)。一旦真核生物mRNA3'端的poly（A）吸附到這些分子上，使用者通過磁場收集偶聯(lián)的磁性顆粒，并從磁珠上洗脫純化mRNA。

CPG公司提供的MPG? mRNA Purification Kit利用磁性分離技術(shù)在15分鐘內(nèi)從總RNA中分離純化mRNA。該公司還提供了MPG Direct mRNA Purification kit試劑盒用于直接從動物或者植物組織和細(xì)胞中分離mRNA，而不需要總RNA分離的起始步驟。

mRNA的分離僅僅是RT-PCR, Northern blotting, 和 dot blot雜交等實驗的的*步。Roche公司提供了 MagNA Pure LC mRNA Isolation Kits I 和 II分離細(xì)胞和組織中的mRNA。這些試劑盒包含了所有必需的試劑，為MagNA Pure LC儀器設(shè)計。

GE（Amersham Biosciences）公司的Hybond Atlas RNA Purification and Labeling Kit試劑盒組合了RNA純化、cDNA探針合成和標(biāo)記試劑盒。

總而言之，RNA純化系統(tǒng)的發(fā)展為生命科學(xué)家?guī)砹苏嬲膶嵒荩瑢⑺麄儚募夹g(shù)難點和有害身體的操作流程中解放了出來，現(xiàn)在的研究人員只需將工作的重點集中在RNA樣品的后續(xù)使用上，而不是它們的制備上，這真是令人愉悅的一件事。