如何進(jìn)行細(xì)胞分離技術(shù)

【資料簡(jiǎn)介】

一、離心技術(shù)

離心是研究如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體，以及各種大分子基本手段。一般認(rèn)為，轉(zhuǎn)速為10~25Kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)；轉(zhuǎn)速超過(guò)25Kr/min，離心力大于89Kｇ者稱為超速離心機(jī)。目前超速離心機(jī)的zui高轉(zhuǎn)速可達(dá)100Kr/min，離心力超過(guò)500Kg。

1.  差速離心（differential centrifugation）

在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器

在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、zui后為核蛋白體。

由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)2～3次效果會(huì)好一些。

差速離心只用于分離大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。通過(guò)差速離心可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過(guò)密度梯離心再行分離純化。

2.  密度梯度離心（density gradient centrifugation）

用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；2）PH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時(shí)滲透壓不大；4）對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。

（1）速度沉降

速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的zui大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的zui小密度。

生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。

（2）等密度沉降

等密度沉降（isopycnic sedimentation）適用于分離密度不等的顆粒。

細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長(zhǎng)時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。

等密度沉降通常在較高密度的介質(zhì)中進(jìn)行。介質(zhì)的zui高密度應(yīng)大于被分離組分的zui大密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。再者，這種方法所需要的力場(chǎng)通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速離心，離心時(shí)間也較長(zhǎng)。大的離心力、長(zhǎng)的離心時(shí)間都對(duì)細(xì)胞不利。大細(xì)胞比小細(xì)胞更易受高離心力的損傷，而且停留在等密度介質(zhì)中的細(xì)胞比處在移動(dòng)中的細(xì)胞受到更大的損傷。因此，這種方法適于分離細(xì)胞器，而不太適于分離和純化細(xì)胞。

二、流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。在分析或分選過(guò)程中，包在鞘液中的細(xì)胞通過(guò)高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)（flow cytometer）。

三、細(xì)胞電泳

在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場(chǎng)的作用下發(fā)生泳動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞電泳（cell electrophoresis）。引起細(xì)胞電泳的電位值稱為ξ電位。各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞荷電量有所不同，故在一定的電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度不同。在恒定的電場(chǎng)條件下，同種細(xì)胞的電泳速度相當(dāng)穩(wěn)定，因而可通過(guò)測(cè)定電泳速度來(lái)推算出細(xì)胞的ξ電位。ξ電位常因細(xì)胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)而異，因此在診斷疾病上有一定價(jià)值。此外由于不同類型的細(xì)胞在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度不同，細(xì)胞電泳尚可用來(lái)分離不同種類的細(xì)胞，例如可把淋巴樣細(xì)胞與造血細(xì)胞分開。