原代細(xì)胞的培養(yǎng)和維持

【資料簡介】

一、原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持

1、靜置貼壁細(xì)胞（包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)）

凡經(jīng)消化液處理實(shí)體組織來源的細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性，細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為5×108細(xì)胞/L,培養(yǎng)基可用Eagle（MEM）或DNEM培養(yǎng)，小牛血清濃度為10%~80%。在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮。

貼壁細(xì)胞長成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，由于營養(yǎng)缺乏，代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，不適宜細(xì)胞生長，此時(shí)細(xì)胞還未長成單層，未達(dá)到飽和密度，仍需繼續(xù)培養(yǎng)，因此，需采取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖的需要。其換液方法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養(yǎng)液相同的等量*培養(yǎng)基。

2、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)

凡來自外周血、胸腹水、脾臟、淋巴結(jié)、骨髓的淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及白血病細(xì)胞，在原代培養(yǎng)時(shí)要盡量去除紅細(xì)胞。若要將淋巴細(xì)胞及白血病細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞中要加入生長因子，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)胞生長，待細(xì)胞開始增殖甚至結(jié)成小團(tuán)塊，培養(yǎng)基中pH變酸，說明細(xì)胞生長繁殖良好，一般每隔3天需半量換液一次（換液時(shí)盡量使細(xì)胞不丟失），待細(xì)胞增殖加快，濃度明顯增加，pH發(fā)生明顯變化時(shí)，此時(shí)可考慮傳代。

懸浮細(xì)胞在未達(dá)到飽和密度時(shí)，但培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營養(yǎng)需求時(shí)，只能采用半量換液的方式。

二、原代細(xì)胞培養(yǎng)的傳代 （Subculture）

這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過程稱之為傳代。每進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代，傳至5~10代以內(nèi)的細(xì)胞通常稱為次代培養(yǎng)細(xì)胞，傳至10~20代以上的細(xì)胞，通常確定為傳代細(xì)胞（或稱傳代細(xì)胞系）。傳代細(xì)胞系的建立，關(guān)鍵是初代培養(yǎng)的傳代。應(yīng)注意如下幾點(diǎn)：

（1）細(xì)胞生長密度不高時(shí)，或未能達(dá)到覆蓋整個(gè)瓶底時(shí)不能急于傳代。

（2）原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞多為混雜細(xì)胞，形態(tài)各異，往往是上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞并存，采用消化時(shí)要掌握好消化時(shí)間，因成纖維細(xì)胞易于脫壁，上皮細(xì)胞不易脫壁，因此，可根據(jù)需要選用適當(dāng)?shù)南瘯r(shí)間及時(shí)中止消化。在早先傳代時(shí)，其消化時(shí)間比一般已建系的細(xì)胞相對(duì)長一些。

（3）吹打已消化的細(xì)胞要輕巧，既不能聽到有明顯的吹打聲，又不能有大量泡沫在懸液中形成，以盡可能減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。

（4）傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，以利于細(xì)胞的生存和繁殖。如果消化分離的細(xì)胞懸液有組織塊，也一并傳入到培養(yǎng)瓶，盡量減少細(xì)胞損失。

（5）傳代培養(yǎng)時(shí)的pH不能高，寧可偏低一些。此外，小牛血清濃度可適當(dāng)加大至15%~20%左右。