夾心法ELISA檢測可溶性白介素2受體實驗方法

【資料簡介】

可溶性白細胞介素2受體SIL-2R存在于人的血清、尿液及腦脊液中，其濃度的高低與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療效果及預(yù)后有密切，如成人T淋巴細胞白血病(ATL)艾滋病、B細胞慢淋、毛細胞白血病，以及腎移植后發(fā)生急性排斥反應(yīng)時或異基因骨髓移植發(fā)生移植物抗宿主時，患者血清中SIL-2R水平明顯升高。SIL-2R的檢測多采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，其中夾心法ELISA是一種較簡單的檢測方法，國外已廣泛應(yīng)用于臨床及基礎(chǔ)免疫學(xué)研究。

㈠ 基本原理：

將抗Tac特異性單克隆抗體Ab1吸附于固相載體，識別細胞培養(yǎng)上清或血清等標本中Tac并與之結(jié)合。應(yīng)用辣根過氧化物酶標記的識別另一種Tac表位的特異性單克隆抗體Ab2識別固定于固相載體的Tac并與之結(jié)合。通過酶催化底物顯色反映待檢標本中游離Tac的水平。

㈡ 操作步驟：

1. 刺激外周血單個核細胞(PBMC)：取外周血10ml，肝素抗凝，常規(guī)分離單個核細胞，加至24孔細胞培養(yǎng)板，2×106/孔，RPMI1640-10%FCS+PHA(3μg/ml，Wellcome公司，37℃、5%CO2培養(yǎng)72小時,收集上清，-20℃保存待測。同時設(shè)未加PHA對照組。犚2可選用病人血清為待測標本。

2. Ab1包被：用0.05MpH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗Tac特異性單克隆抗體(Ab1)犗!釋至5μg/ml，加至elisa板，100μl/孔，4℃包被72小時。

3. 封閉：1%BSA-PBS封閉，350μl/孔，37℃孵育2小時。

4. 加樣：ELISA板用PBS-T洗液洗3次，牻+PHA刺激單個核細胞培養(yǎng)上清及對照組上清或病人血清倍比稀釋至1∶1024，每一稀釋度取100μl加至ELISA板。犙!HUT-102B2細胞培養(yǎng)上清為陽性對照，RPMI1640-10%FCS培養(yǎng)液為陰性對照。37℃，孵育2小時，洗滌。

5. 加酶標抗體：于各反應(yīng)孔加辣根過氧化物酶標記另一種抗 Tac 特異性單克隆抗體Ab2以效價滴定的*稀釋度稀釋)100μl。37℃孵育2小時，洗滌。

6. 加底物顯色：各反應(yīng)孔加新鮮配制ABTS底物溶液100μl，37℃、孵育15分鐘。

7. 終止反應(yīng)：各反應(yīng)孔加2%氟化鈉終止液50μl。

8. 結(jié)果判定：首先肉眼觀察反應(yīng)孔內(nèi)顏色，稀釋梯度是否均勻。陽性、犚u性結(jié)果是否明顯。然后于ELISA檢測儀上測各孔O.D值(410nm)。

㈢ 試劑器材：

1. 試劑：包被緩沖液、洗滌液、稀釋液、終止液配制同常規(guī)ELISA方法。Tac特異性單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的Tac特異性單克隆抗體,HUT-102B2細胞培養(yǎng)上清,PHA。

2. 器材：聚苯乙烯塑料板，ELISA檢測儀，37℃水浴箱，4℃冰箱，CO2孵箱?？烧{(diào)加樣器。

㈣ 注意事項：

1. 包被抗體活性要較高，否則影響本實驗敏感性。

2. 經(jīng)篩選比較，封閉液以1%BSA-PBS為好。

3. 酶標結(jié)合物應(yīng)用前應(yīng)進行效價滴定，選擇*工作濃度。

4. 底物應(yīng)選用靈敏度較高的供氫體如ABTS等。

5. 如有條件，酶標McAb可由*-McAb和親和素-HRP系統(tǒng)代替，以增加實驗的敏感性。