蛋白質(zhì)的生物合成標記實驗

【資料簡介】

實驗材料    蛋白質(zhì)
試劑、試劑盒    *PBS
儀器、耗材    培養(yǎng)箱離心管
實驗步驟    
1.  培養(yǎng)懸浮細胞至對數(shù)增*，室溫300 g 離心5 min?；厥?07~108細胞。
 
2.  每2×107細胞用約10 ml 37℃的短時間標記培養(yǎng)基在圓錐型試管中洗滌，于室溫300 g 離心5 min 回收細胞，小心重懸細胞并重復(fù)洗滌過程。

3.  以37℃的短時間標記培養(yǎng)基重懸至5×106細胞/ml，于37℃保溫15 min 以耗盡細胞內(nèi)的甲硫氮酸，間歇搖動。

4.  室溫解凍［35S］*，并用37℃短時間標記培養(yǎng)基來配制含0.1~0.2 mCi/ml 的工作液。
 
5.  室溫300 g 離心5 min，回收細胞，每2×107細胞以4 ml［35S］工作液重懸于圓錐試管。37℃水浴保溫30 min~3 h，頻繁翻覆試管以混懸細胞。

6.  4℃ 300 g 離心回收細胞，小心重懸于10 min 冰冷PBS緩沖液，重復(fù)離心操作。

7.  必要時，用TCA沉淀法確定放射性標記的摻入量，按免疫親和層析、免疫沉淀法和單向和雙向凝膠電泳處理和分析細胞。
收起 
注意事項    
1.  在標記過程，會釋放揮發(fā)性的［35S］化合物，在使用前須把過于37℃水浴的［35S］*緊緊密封，不要在37℃放置超過30 min。

2.  培養(yǎng)液和冼滌液具放射性，須遵循放射性物質(zhì)的使用和丟棄的安全守則進行。
實驗材料    細胞
試劑、試劑盒    PBS*
儀器、耗材    培養(yǎng)箱離心機
實驗步驟    
1.  在100 mm 直徑的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)貼壁細胞（0.5~2×107）至70%~90%匯片，吸去培養(yǎng)液，用10 ml 于37℃短時間標記培養(yǎng)基輕輕搖晃冼兩次細胞。

2.  加入5 ml 于37℃短時間標記培養(yǎng)基，在5%CO2的加濕培養(yǎng)箱于37℃溫育15 min，以耗盡細胞內(nèi)的*。

3.  制備［35S］*工作液。

4.  除去細胞上的培養(yǎng)液，加入2~4 ml ［35S］*工作液，在5%CO2的加濕培養(yǎng)箱于37℃溫育30 min~3 h。

5.  除去細胞上的培養(yǎng)液，用10 冰冷PBS緩沖液洗細胞1次后棄去，加入10 ml 冰冷PBS刮下培養(yǎng)皿上的細胞。
 
6.  將細胞懸液移至15 ml 圓錐試管，于4℃ 300 g 離心5 min，棄上清。

7.  處理和分析細胞。

實驗材料    細胞
試劑、試劑盒    *PBS
儀器、耗材    離心機培養(yǎng)箱
實驗步驟    
1.  準備和用［35S］*標記細胞，用0.2~1 mCi/ml 的［35S］甲疏氨酸脈沖標記細胞5~30 min。
 
2.  脈沖標記后，除去［35S］*培養(yǎng)基，用10 ml 于37℃追加培養(yǎng)基冼細胞1次，加入10 ml 追加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
 
3.  在37℃溫育至設(shè)定時間。懸浮培養(yǎng)細胞在蓋緊蓋子的試管中旋轉(zhuǎn)溫育，貼附培養(yǎng)細胞在37℃ 5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
 
4.  于4 ℃300 g 離心收集懸浮培養(yǎng)細胞，棄上清。

5.  刮下貼附培養(yǎng)細胞，并移入15 ml 圓錐試管，300 g 離心5 min，棄上清。用10 ml 冰冷PBS緩沖液洗1次，重復(fù)離心。

6.  處理及分析細胞。