免疫酶法的特點(diǎn)和各種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)比

【資料簡(jiǎn)介】

1966年，Nakane等人用酶代替標(biāo)記抗體，之后Sternbenger等成功引入非標(biāo)記抗體，使得免疫酶法得到長(zhǎng)足的發(fā)展，并成為應(yīng)用zui廣泛的免疫組化技術(shù)。下面將介紹免疫酶法的優(yōu)點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)方法等內(nèi)容。

免疫酶法是借助酶細(xì)胞化學(xué)等手段顯示組織抗原(或抗體)的新技術(shù)，是在免疫熒光法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。免疫酶法的基本原理與免疫熒光法有所相似，免疫酶法是將酶以共價(jià)鍵的形式結(jié)合在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借助酶對(duì)底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部各種抗原成分的定位。已如前述，免疫熒光法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏、特異性高、省時(shí)的優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)也具有令人遺憾的不足，特別是熒光標(biāo)本不能*保存以及需要價(jià)格昂貴的熒光顯微鏡才能觀察的問(wèn)題。為此，Nakane等人(1966)嘗試了用酶代替熒光素來(lái)標(biāo)記抗體的方法，從而成功地開(kāi)創(chuàng)了酶標(biāo)記抗體的新技術(shù)(酶標(biāo)抗體法)。Sternbenger等人又將非標(biāo)記抗體過(guò)氧化物酶法成功地引人，使免疫酶法有了很大的進(jìn)步，成為當(dāng)今使用的免疫組織化學(xué)技術(shù)。

免疫酶法與免疫熒光法相比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)：酶反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)的顏色不僅能在一般的普通生物顯微鏡下觀察，而且其產(chǎn)物因具有一定的電子密度也可在電鏡下觀察(免疫電鏡技術(shù))，光鏡與電鏡的結(jié)合，使靈敏度進(jìn)一步提高，標(biāo)本又能*保存，并能加設(shè)HE染色等其他復(fù)染，有利于將被檢測(cè)物質(zhì)與病變的形態(tài)學(xué)改變起來(lái)(定性與定位)，彌補(bǔ)了免疫熒光法的不足。

從理論上講，用細(xì)胞化學(xué)方法能顯示的酶，均可用于標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫酶法染色，但實(shí)際上能用于免疫組織化學(xué)技術(shù)的酶并不多。sternbenger等人指出：用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下六點(diǎn)：

1) 酶催化的底物必需是特異的，而且容易被顯示，即催化反應(yīng)所形成的產(chǎn)物易于 在光鏡和電鏡下觀察。

2) 酶反應(yīng)的終產(chǎn)物所形成的沉淀必須穩(wěn)定，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，而影響組織學(xué)定位。

3) 較易獲得純的酶分子。

4) 中性PH值時(shí)，酶分子應(yīng)穩(wěn)定。

5) 在酶標(biāo)過(guò)程中，酶連接在抗體上，不能影響二者的活性。

6) 被檢組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類似的物質(zhì)，否則結(jié)果將難以判定。

上述六點(diǎn)中以1.2兩點(diǎn)zui為重要，因?yàn)椴⒎撬械娜菀罪@示的酶均能形成不溶性的復(fù)合物。符合上述要求的，zui為常用的酶是辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，H：：flJ)。其次是堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)，除此兩種外，還有葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOD)等，但因其形成的不溶性色素?cái)U(kuò)散作用較大，在應(yīng)用上受到很大限制。 HRP廣泛分布于植物界，因其辣根含量zui高而得名。它是由無(wú)色酶蛋白和深棕色的鐵葉結(jié)合組成的一種糖蛋白(糖占18%左右)，分子量為40000道爾頓，等電點(diǎn)3~9，zui適 PH為 5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的飽和硫酸鉸溶液，其活性部分為鐵葉琳，稱輔基。酶的蛋白部分無(wú)活性。酶蛋白和鐵葉琳輔基的zui大吸收光譜分別為275urn和403urn;HRP的純度用兩者的光密度比值(M03人工衛(wèi)75)來(lái)衡量，以RZ(Reinheitzahi)來(lái)表示。一般認(rèn)為，標(biāo)記酶的RZ值為 3.0左右，不應(yīng)<2.8，RZ值越小，酶的純度越差，對(duì)于純度低，質(zhì)量差的酶，需經(jīng)純化后才能使用。

AKP是一種磷酸酶的水解酶，磷酸單酯酶對(duì)于連接于作用物磷酸基上的醇基沒(méi)有特異性，因它可以水解多種有機(jī)磷酸酯，生成醇和磷酸鹽離子。該酶在許多人體組織或動(dòng)物組織中有分布，如肝、胎盤(pán)、白細(xì)胞、腎、小腸等。AKP的分子量為80KD，zui適PH為9.8，其活性受底物及濃度、緩沖液及其離子濃度等因素影響，如用二乙醇胺緩沖液(1mol/L，PH9.8)對(duì)AICI’具有活化作用，酶的活性高，而用*一NaOH緩沖液則對(duì)AKP有抑制作用。AKP的活化劑有鎂和錳離子，Mg++的適應(yīng)濃度為10mol/L。*、檸檬酸鹽，EDTA等對(duì) AKP有抑制作用。AKP對(duì)溫度具有較高的敏感性，從 25℃增加到 35℃，其催化反應(yīng)速度增加 1.5倍。當(dāng)選用不同的底物時(shí)，AKP可催化形成不同顏色的終產(chǎn)物。例如，萘酚一AS一MX和快藍(lán)(Fast blue，F(xiàn)h)為底物時(shí)生成藍(lán)色產(chǎn)物，可與HRP催化的產(chǎn)物形成鮮明的對(duì)比，用快紅(Fast red)代替快藍(lán)則生成紅色不溶性產(chǎn)物，而且內(nèi)源性AKP較易清除，可以較好地避免內(nèi)源性酶的干擾，使其具備了某些*的優(yōu)點(diǎn)而日益?zhèn)涫苤匾暋?/p>

GOD所催化的底物為葡萄糖，電子供體為對(duì)硝基藍(lán)四隆(Paranitroblue Tetrazolium)，終產(chǎn)物比較穩(wěn)定，為不溶性的藍(lán)色沉淀。從理論上講，GOD較AKP和HRP為佳，因?yàn)椴溉閯?dòng)物組織內(nèi)不存在內(nèi)源性葡萄糖氧化酶，這樣可以很好地避免內(nèi)源性酶的干擾。但是，GOD的分子較HRP大三倍，具有較多的氨基，在標(biāo)記時(shí)易形成廣泛的聚合，而影響酶的活性。

免疫酶法與免疫熒光法大致相同，也可以分為以下幾種。

(1)直接法

用酶標(biāo)記的特異性抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合，再與酶的底物作用產(chǎn)生有色的產(chǎn)物，沉積在抗原抗體反應(yīng)的部位，即可對(duì)抗原進(jìn)行定性、定位以至定量研究。

直接法的*步是特異的——即酶催化底物的反應(yīng)，其余步驟則是非特異的，可用各種電子供體介導(dǎo)。以HRP為例，HRP的底物是巴H2O2，在分解已過(guò)程中，與H2O2形成初級(jí)復(fù)合物，無(wú)電子供體存在時(shí)，反應(yīng)不再繼續(xù)進(jìn)行，當(dāng)電子供體存在時(shí)，反應(yīng)以一定的速度形成第二種復(fù)合物，繼之HRP催化H2O2所形成的中間型產(chǎn)物，迅速生成水，酶被還原，電子供氫體被氧化，聚合，再經(jīng)氧化環(huán)化，zui后形成引哚胺多聚體，于酶反應(yīng)部位，形成不溶性棕褐色沉淀，與組織對(duì)比清晰，達(dá)到定位、定性、定量的目的。

直接法簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)，非特異性背景反應(yīng)低。其缺點(diǎn)是，每種抗原必須分別用其抗體的酶標(biāo)記物，且敏感性較間接法低。

(2)間接法

間接法是先用未標(biāo)記的特異性抗體(一抗)與標(biāo)本中相應(yīng)抗原反應(yīng)，再用抗特異性抗的酶標(biāo)記抗體與結(jié)合在抗原上的一抗(即特異性抗體)反應(yīng)。例如，*次使用的特異性抗體(一抗)是由家兔產(chǎn)生的，則第二次使用的抗體(二抗)必須是酶標(biāo)記的抗兔的免疫球蛋白，常用的羊抗兔lgG的酶標(biāo)記物(即酶標(biāo)羊抗兔IgG)。然后與直接法相同，與底物反應(yīng)、顯色、將抗原的性質(zhì)，部位和含量檢測(cè)出來(lái)。

間接法的優(yōu)點(diǎn)是用一種酶標(biāo)抗體就可與多種特異性一抗配合而檢查多種抗原，而且敏感性也優(yōu)于直接法。

(3)酶橋法

酶橋法的建立是免疫酶法重大改進(jìn)的標(biāo)志。將用化學(xué)交聯(lián)法將酶與抗體分子結(jié)合的技術(shù)改進(jìn)為用酶和酶抗體免疫反應(yīng)而結(jié)合的方法，避免了由于化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中對(duì)酶活性和抗體效價(jià)的不良影響。其基本原理是用酶免疫動(dòng)物，制備價(jià)、特異性強(qiáng)的抗酶抗體，然后用第二抗體作橋，將抗酶抗體和特異性的*抗體(即連結(jié)在組織抗原上的抗體)連接起來(lái)，再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，經(jīng)過(guò)酶催化底物的顯色反應(yīng)后，顯示出抗原所在的部位及含量。作為橋的第二抗體(即橋抗)必須對(duì)特異性抗體(一抗)和酶抗體都具有特異 性，這樣才能將二者相連起來(lái)，因此，一抗和酶抗體應(yīng)由同一種屬動(dòng)物產(chǎn)生。例如，特異性抗體和酶抗體都是兔產(chǎn)生的，再用羊抗兔IgG作為橋抗體就能將兩者連接起來(lái)。在此 過(guò)程中，由于任何抗體均未被酶標(biāo)記，酶是通過(guò)免疫學(xué)原理與抗酶抗體結(jié)合的，避免了共價(jià)連接對(duì)酶活性的影響，提高了方法的敏感性，同時(shí)也節(jié)省了特異性抗體(即一抗)的用量。

酶橋法雖然克服酶標(biāo)記抗體法的缺點(diǎn)，較好地保護(hù)了抗體和酶的活性，但是仍存在不足，其主要表現(xiàn)為①在抗酶抗體的抗血清中，含有低親和力和高親和力兩類抗體，它們作為抗原與抗體結(jié)合，主要依賴于橋抗體對(duì)它的親和力，而與其本身對(duì)酶的親和力無(wú)關(guān)，故兩者均可被連接在橋抗體上，由于低親和力的抗酶抗體與酶結(jié)合較弱，漂洗時(shí)易解離，使部分酶丟失，從而降低了方法的敏感性。②抗酶抗體血清中，亦含有非特異性抗體，其抗原性與抗酶抗體相同，所以能與橋抗體結(jié)合，但卻不能與酶結(jié)合，這樣影響了組織抗原的顯示。為解決這些不足，70年代初，Sternberg在各種標(biāo)記抗體法和酶橋法的基礎(chǔ)上，建立了PAP法，并加以改良，成為應(yīng)用的免疫組織化學(xué)技術(shù)之一。

(4)PAP法

PAP法是酶橋法等基礎(chǔ)之上建立的，其基本原理與酶橋法相似，都是利用橋抗體將 酶連接在*抗體結(jié)合的部位，所不同的是，將酶和抗酶抗體制成復(fù)合物(PAP)以代替酶橋法中的抗酶抗體和隨后結(jié)合的酶，將兩個(gè)步驟合并為一個(gè)步驟，這一重要的改進(jìn)，不僅僅是簡(jiǎn)化步驟，而具有更大的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)镻AP是由3個(gè)過(guò)氧化物酶分子和2個(gè)抗酶抗體分子結(jié)合形成的一個(gè)環(huán)形分子，排列呈五角形結(jié)構(gòu)，3個(gè)角辣根過(guò)氧化酶(HRP)，另2個(gè)角為抗HRP抗體，其分子量為400，000~430，000道爾頓，直徑約為20.5nm，這種結(jié)構(gòu)異常穩(wěn)定，沖洗時(shí)酶分子不會(huì)脫落，從而大大提高了敏感性，Petrali等報(bào)告，PAP法比酶橋法靈敏度高20倍。有人認(rèn)為是免疫熒光法的100~1000倍。

PAP法應(yīng)用廣泛，其主要優(yōu)點(diǎn)為：

1) zui大限度地保存了抗體活性。

因?yàn)樵谒械姆磻?yīng)過(guò)程中，任何抗體均未被酶標(biāo)記，避免了標(biāo)記過(guò)程中對(duì)抗體活性的損害。

2) 靈敏度高。

由于是多層抗原抗體反應(yīng)，由于免疫放大作用，使得結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的酶分子增多，并且PAP法復(fù)合物性質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這樣與酶底物反應(yīng)后的呈色反應(yīng)增強(qiáng)，使微量的或抗原性弱的抗原顯示出來(lái)，提高了靈敏度。

3) 背景淡。

酶橋法中，酶標(biāo)記的非特異性抗體可與組織抗原結(jié)合，引起背景染色，給結(jié)果判斷帶來(lái)了很大的困難。

PAP法中，連接抗體中即使存在著非特異性抗體，因其不是抗IgG的特異性抗體，故不能與抗HRP抗體相結(jié)合，也就不能把PAP復(fù)合物連接在非特異性抗體上。當(dāng)然PAP復(fù)合物內(nèi)也可存在一些非HRP特異性抗體，假如這部分抗體能夠與橋抗體及組織成分相結(jié)合，但因其不是抗HRP抗體，所以不能與HRP結(jié)合，也就無(wú)酶活性及背景染色。背景越淡，當(dāng)然越有利于結(jié)果的判斷。

PAP法的不足之處是PAP的制備較為復(fù)雜。

雙PAP法又稱雙橋法(double bridged technique)，是PAP法的重要改進(jìn)，通過(guò)兩次連接橋抗體和PAP，在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合了比PAP法更多的酶分子，可提高敏感性達(dá)20~50倍。一般認(rèn)為，雙PAP法通過(guò)下述途徑來(lái)提高敏感性，①重復(fù)的橋抗體與PAP中的抗HRP抗體的抗原未飽和位置結(jié)合，再連接PAP復(fù)合物，即在抗原之處，抗體間形成更大的抗原抗體復(fù)合物，具有多個(gè)酶分子，使免疫染色增強(qiáng)。②重復(fù)的橋抗體，與特異性的*抗體未飽和抗原相結(jié)合，使*抗體上結(jié)合較多的橋抗體和PAP復(fù)合物，起到放大作用。雙PAP法的不足之處是步驟多，需時(shí)長(zhǎng)，在實(shí)際操作中，可能會(huì)帶來(lái)非特異性放大的問(wèn)題而影響結(jié)果的判斷。

(5)APAAP法

APAAP——堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase antialkaline phosphatase, APAAP)法是Mason和Moir(1983)等在PAP法的基礎(chǔ)上，用AKP替代HRP而建立的一種方法，都屬于未標(biāo)記抗體橋聯(lián)法。APAAP法與PAP一樣，利用橋抗體將AKP連接在*抗體的結(jié)合部位，而AKP和抗AKP抗體被制成復(fù)合物(APAAP)，通過(guò)APAAP復(fù)合物中的AKP催化底物顯色以顯示抗原物質(zhì)。

APAAP法的主要優(yōu)點(diǎn)：

1) 在內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶較高的組織中進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色時(shí)，APAAP法較PAP法具有更多的優(yōu)勢(shì)，僅需稍加處理就能消除內(nèi)源性酶的干擾，而PAP法則困難較大。

2) 敏感性與PAP法大致相似。

3) 在血、骨髓、脫落細(xì)胞涂片的免疫細(xì)胞化學(xué)染色上具有PAP法不能替代的優(yōu)勢(shì)。

4) 反應(yīng)穩(wěn)定，著色清楚，背景淡。

免疫酶法分為直接法、間接法、酶橋法、PAP法和APAAP法。其中的PAP法和APAAP法應(yīng)用較為廣泛，不過(guò)PAP的制備較為復(fù)雜，而APAAP法建立在PAP法的基礎(chǔ)上，能有效彌補(bǔ)PAP法的不足。