己糖激酶（hexokinase，HK）試劑盒說(shuō)明書(shū)

【資料簡(jiǎn)介】

己糖激酶(hexokinase，HK)試劑盒說(shuō)明書(shū)   
分光光度法  50 管/48 樣 
測(cè)定意義 
HK（EC 2.7.1.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是葡萄糖分解過(guò)程中的第
一個(gè)關(guān)鍵酶，催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交
叉點(diǎn)。 
測(cè)定原理 
HK 催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化 6-磷酸葡萄糖脫氫生成
NADPH，NADPH 在 340nm有特征吸收峰。 
需自備的儀器和用品 
紫外分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰
和蒸餾水。 
試劑的組成和配制 
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；   
試劑一：液體30mL×1瓶，  4℃保存； 
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 30mL蒸餾水充分溶解備用； 
試劑三：液體5 mL×1瓶，4℃保存； 
試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 4mL蒸餾水充分溶解備用； 
試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 2mL蒸餾水充分溶解備用； 
試劑六： 粉劑×1 支， -20℃保存； 臨用前加入 250μL試劑一和 250μL蒸餾水充分溶解備用；  
樣本的前處理 
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量
（104
個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL提
取液） ，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲 3s，間隔10s，重復(fù)30 次）；
8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 
2、組織：按照組織質(zhì)量（g） ：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g組織，
加入 1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。 
3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。 
測(cè)定步驟 
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。 
2、 將試劑一、二、三、四和五 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱10 分鐘。 
3、 加樣表： 
試劑名稱(chēng)（μL）  測(cè)定管 
試劑一  400 
試劑二  400 
試劑三  80 
試劑四  80 
試劑五  40 
試劑六  8 
樣本  30 
將上述試劑按順序加入 1 mL石英比色皿中，立即混勻，加樣本的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，在 340 nm
波長(zhǎng)下記錄 20秒時(shí)的初始吸光度 A1和 5 分 20秒時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。 注意事項(xiàng) 
1、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三、四、五和六按比例配成混合液，預(yù)
熱 10min。 
2、不同勻漿組織中 HK 活力不一樣，做正式試驗(yàn)之前請(qǐng)做1-2只預(yù)試，若 ΔA>0.5，則說(shuō)明
組織活力太高，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），
或縮短反應(yīng)時(shí)間至 2min,使 ΔA<0.5，以提高檢測(cè)靈敏度。 
HK活性計(jì)算 
1、血清（漿）HK 活性 
單位的定義：每毫升血清（漿）在每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 
HK（U/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109
]÷V樣÷T=1113×ΔA 
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中HK 活性 
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算 
單位的定義：每 mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 
HK（U/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109
]÷(V樣×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr 
（2）按樣本鮮重計(jì)算 
單位的定義：每 g組織每分鐘生成 1 nmol的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 
HK（U/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109
]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=1113×ΔA÷W 
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算 
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 
HK（U/104
 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109
]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=2.226×ΔA 
V反總：反應(yīng)體系總體積，1.038×10-3
 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103
 L / mol /cm；
d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；
T：反應(yīng)時(shí)間，5  min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)
胞總數(shù)，500萬(wàn)。