鐵蛋白免疫電鏡實(shí)驗(yàn)

【資料簡介】

實(shí)驗(yàn)方法原理    免疫鐵蛋白技術(shù)是以鐵蛋白標(biāo)記抗體，再以鐵蛋白抗體與待檢抗原作用。通過電鏡檢查，觀察到鐵蛋白抗體所在的位置，即抗原所在。
實(shí)驗(yàn)材料    馬脾鐵蛋白
試劑、試劑盒    硫酸銨硫酸鎘雙異氰酸鎘二甲苯硼鹽酸緩沖液硫酸銨液 PBS蒸餾水
儀器、耗材    離心機(jī)顯微鏡微孔濾膜
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、材料與試劑準(zhǔn)備
 
1.  馬脾鐵蛋白
 
2.  硫酸銨
 
3.  硫酸鎘
 
4.  雙異氰酸鎘二甲苯(Metaxylene dlisocyante  XC)：以0.30 mol/L pH9.5硼酸鹽緩沖液將XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必須特別清潔，配制后放置4℃數(shù)天，以不出現(xiàn)沉淀為準(zhǔn)。如出現(xiàn)沉淀XC的多聚體形成，應(yīng)重配。
 
5.  0.30 mol/L pH9.5硼鹽酸緩沖液
 
6.  0.1 mol/L 硫酸銨液
 
7.  0.05 mol/L pH7.4 PBS液
 
二、操作方法
 
1.  鐵蛋白的提取
 
（1） 配制2%硫酸銨液，并以1 mol/L的NaOH或HCl調(diào)pH值，正好為5.85。取1 g鐵蛋白溶于100 ml的2%硫酸銨液中。
 
（2） 加入20%硫酸鎘，使zui終濃度為5%，混勻，4℃。
 
（3）1 500 g離心(4℃)2 h，去上清。仍加2%硫酸銨至100 ml，混勻，離心，去除不純沉渣。
 
（4）于上清液中重新加入20%硫酸鎘，重復(fù)步驟⑵，離心，去上清。
 
（5） 檢查沉渣，置顯微鏡下檢查，應(yīng)具有典型的黃褐色結(jié)晶，結(jié)晶為六角形，雙一四點(diǎn)結(jié)構(gòu)，如結(jié)晶不典型，應(yīng)繼續(xù)重復(fù)以上步驟。
 
（6）以少量的蒸餾水溶解，再加50%飽和硫酸銨溶液，使之沉淀，離心，去上清。
 
（7）重復(fù)步驟⑹一次。
 
（8） 以少量蒸餾水溶解，常水透析24 h后，以0.05 mol/L pH7.5 PBS透析24 h。
 
（9） 100 000 r/min離心2 h，去除上部無色上清液(約3/4總量)，置4℃。
 
（10）用微孔濾膜(孔徑0.45 μm)過濾，使鐵蛋白含量為65 mg/ml～75 mg/ml，分裝，4℃保存不要凍干保存，以免鐵蛋白結(jié)構(gòu)遭破壞。
 
2.  鐵蛋白－抗體交聯(lián)
 
（1） 以0.3 mol/L pH9.5硼酸鹽緩沖液將鐵蛋白稀釋成20 mg/ml～25 mg/ml。
 
（2）以1︰1 000(W/W)的比例加入XC液室溫?cái)嚢?5 min，離心去沉淀。
 
（3） 以0.3 mol/L pH9.5硼酸鹽緩沖液將提純lgG配成5 mg/ml，以1︰4的比例(V/V)加入IgG與鐵蛋白－XC液，4℃攪拌48 h。
 
（4）以0.1 mol/L碳酸銨溶液透析，以除去多余的異氰酸鹽，再以0.05 mol/l pH7.5 PBS透析，使pH值恢復(fù)到生理水平。
 
（5） 超速離心  以1.00×10 5 g離心5 h，去上清，沉淀以0.05 mol/L PBS懸浮，再次離心，以除去未結(jié)合的IgG。
 
（6） 以血清學(xué)及免疫學(xué)方法測(cè)定結(jié)合抗體的特異性、免疫活性以及標(biāo)記效應(yīng)，如果操作步驟嚴(yán)格，結(jié)果是滿意的。
 
3.  鐵蛋白－抗體結(jié)合物處理標(biāo)本
 
（1） 將標(biāo)本以5%福爾馬林pH7.2(4℃)PBS液固定40 min～60 min。
 
（2） 用冷的PBS液洗滌，離心。
 
（3） 如是組織塊，則在解剖顯微鏡下切成更小塊，放入試管中，加入鐵蛋白－抗體結(jié)合物置室溫20 min，不時(shí)振蕩。
 
（4） 以冷PBS液洗滌三次，離心。
 
（5） 沉淀以2.5%戊二醛固定20 min，以PBS洗滌。
 
（6） 再以鋨酸固定，脫水包埋。
 
也可以先超薄切片，再進(jìn)行鐵蛋白－抗體結(jié)合物染色。操作如下：
 
（1） 將培養(yǎng)細(xì)胞以1%福爾馬林PBS液固定(4℃)。
 
（2）PBS液洗滌離心。
 
（3） 以0.5 ml，30%牛血清蛋白PBS液懸浮置入膠透析膜袋中，再將袋置于吸水劑粉末上，待牛血清白蛋白成膠狀物時(shí)，將透析袋移至2%戊二醛PBS液（pH7.5）中固定3 h。
 
（4）取出，切成小塊，以PBS液洗滌。
 
（5） 置干燥器中以硅膠干燥。
 
（6） 包埋、切片、在水上收集切片置于經(jīng)4%牛血清白蛋白PBS液處理的披有膠膜的載網(wǎng)上(牛血清白蛋白的處理在于減少鐵蛋白結(jié)合物非特異性吸附于載網(wǎng)上)。
 
（7） 滴一滴鐵蛋白－抗體結(jié)合物于載網(wǎng)上。
 
（8） 5 min后，浮網(wǎng)于PBS液面,標(biāo)本面向下，以除去多余的結(jié)合物。
 
（9）涼干后，滴一滴乙酸雙氧鈾或氫氧化鉛以復(fù)染。水洗、晾干、電鏡觀察。
 
三、結(jié)果判定
 
在已知對(duì)照樣品成立的前提下，凡是出現(xiàn)黑色的鐵分子顆粒即表示抗原的存在，判定陽性(＋)，否則判為陰性(－)。