酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（ELIspot）

【資料簡介】

人皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子（CTACK/CCL27）Elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)材料    血液樣品細(xì)胞樣品
試劑、試劑盒    70％乙醇PBS脫脂奶粉鏈霉親和素檢測抗體包被抗體
儀器、耗材    PVDF膜96孔培養(yǎng)板硝基纖維素底板免疫斑點(diǎn)板酶標(biāo)板
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、包被96孔板 
 
用70％乙醇浸潤96孔板中的PVDF膜30 s
 
加入捕獲抗體（PBS稀釋），4℃
 
倒空板中包被液，輕輕在紙上拍干，用PBS洗滌，禁用洗板機(jī)
 
加入100ul 2%的脫脂奶粉（或者BSA）室溫孵育2小時(shí)，封閉板中空白位點(diǎn)
 
PBS洗滌1次。（如果暫時(shí)不用，可將96孔板干燥后4保存，可保存2周以上）
 
二、細(xì)胞刺激和細(xì)胞因子捕獲 
 
從新鮮血液中用Ficoll分離PBMC并進(jìn)行計(jì)后，將細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋后加入96孔板中。細(xì)胞數(shù)量需要優(yōu)化，進(jìn)行備比稀釋以確定合適的細(xì)胞數(shù)量。通常所用細(xì)胞數(shù)量為1-2×105/孔。
 
將96孔板在37℃ CO2孵箱中孵育。禁止移動(dòng)或晃動(dòng)板子。
 
用含0.1% Tween 20 的PBS孵育10分鐘，去除細(xì)胞和未結(jié)合的細(xì)胞因子。然后用含0.1% Tween 20 的PBS洗滌3次。 禁用洗板機(jī)。
 
三、加入檢測抗體檢測 
 
加入標(biāo)記的檢測抗體（用含1％BSA的PBS稀釋），室溫孵育1-2小時(shí)。
 
加入底物顯色（如果檢測抗體為酶標(biāo)）或者熒光直接檢測（如果檢測抗體是熒光標(biāo)記）：在加入底物之前用蒸餾水洗滌板子膜的兩側(cè)，以防止部分溶液漏出后導(dǎo)致的背景。監(jiān)測斑點(diǎn)的形成，適時(shí)終止反應(yīng)。
 
用蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。
 
四、結(jié)果分析 
 
將96孔板干燥。（將板子放在4℃避光，可使斑點(diǎn)邊緣銳化，更易分辨）
 
使用讀板儀進(jìn)行結(jié)果分析
 
人皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子（CTACK/CCL27）Elisa試劑盒ELISpot實(shí)驗(yàn)需要的試劑：
PVDF包被的96孔板 包被抗體 標(biāo)記的檢測抗體（酶、Biotin、熒光） AP/HRP－鏈霉親和素（如果檢測抗體是Biotin標(biāo)記） 底物溶液 各種緩沖液：包被液、稀釋液、洗滌液等 陽性對照：重組的細(xì)胞因子或者已知產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞 96孔板- 硝基纖維素底板、
收起 
其他    
一、PVDF-底的免疫斑點(diǎn)板或者平底的酶標(biāo)板 ELISpot技術(shù)要點(diǎn)  
 
1.  操作BCIP/NBT顯色液時(shí)戴上手套。
 
2.  為了防止邊緣影響，在96孔扳外面包裹錫箔膜，包裹直到顯色結(jié)束再棄去。
 
3.  加樣細(xì)胞和試劑時(shí)加樣槍頭千萬不能碰觸孔底的PVDF膜，以防止損壞PVDF膜。
 
4.  常用的96孔扳雖然不是無菌的，但是短暫的孵育時(shí)間和培養(yǎng)液中抗生素的存在，ELISpot的操作過程不會(huì)有污染的麻煩。
 
5.  絕大部分板子只能一次做完，請務(wù)必在實(shí)驗(yàn)開始之前設(shè)計(jì)好實(shí)驗(yàn)方案，盡量zui大程度地利用板孔和試劑。
 
6.  檢測抗體和酶現(xiàn)配現(xiàn)用。
 
7.  為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議作雙復(fù)孔或三復(fù)孔。
 
8. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，不要在高于37℃的溫度下干燥，否則PVDF膜可能會(huì)破裂。
 
9. *以下對照設(shè)定：
 
（1）陽性對照：重組細(xì)胞因子或確定能分泌該種細(xì)胞因子的細(xì)胞 陰性對照：相同數(shù)量的未刺激細(xì)胞 背景對照：無菌細(xì)胞培養(yǎng)液 檢測抗體對照：用PBS代替檢測抗體

二、ELISpot技術(shù)介紹 
 
從單細(xì)胞水平觀察分泌蛋白的表達(dá)已成為目前研究細(xì)胞功能的重要內(nèi)容，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISpot)技術(shù)巧妙地運(yùn)用了酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，從方法上解決了該難題，已廣泛運(yùn)用于各項(xiàng)重要課題研究中。ELISpotzui初用于檢測分泌抗原特異性抗體的個(gè)體B細(xì)胞，以后該方法不斷改進(jìn)，用于檢測分泌特定抗原的單個(gè)細(xì)胞。
 
相比較于流式細(xì)胞儀、免疫組化、原位雜交等其它在單細(xì)胞水平檢測蛋白分泌能力的方法，ELISpot方法更為簡單和穩(wěn)定，同時(shí)具有更高的靈敏度。 ELISpot方法操作簡便，但卻能提供非常類似于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境。在單細(xì)胞水平進(jìn)行特定抗原的監(jiān)控，可以模擬體內(nèi)環(huán)境，跟蹤細(xì)胞因子的產(chǎn)生，是檢測細(xì)胞功能的*手段?，F(xiàn)已被廣泛運(yùn)用于世界各大實(shí)驗(yàn)室的疾病診斷和科學(xué)研究活動(dòng)之中。
 
自1983年以來，ELISpot方法得到越來越廣泛的應(yīng)用，主要包括以下幾個(gè)方面：
B細(xì)胞雜交瘤的篩選、 化合物和藥物免疫學(xué)反應(yīng)的篩選、 優(yōu)化樹突細(xì)胞和T細(xì)胞的抗腫瘤活性、 靶向疫苗的質(zhì)控、 自身免疫疾病的診斷和預(yù)后分析、 自身免疫疾病的*的監(jiān)控、 過敏性疾病的脫敏治療的監(jiān)測、 器官移植中排斥反應(yīng)的預(yù)測 、干細(xì)胞功能分析、 基因治療中轉(zhuǎn)染效率的檢測、組織、腫瘤和免疫細(xì)胞低頻分泌譜的分析等等。