大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取

【資料簡介】

一、大腸桿菌質(zhì)粒dna的提取  
質(zhì)粒dna的提取是從事基因工程工作中的一項(xiàng)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，但提取方法有很多種，以下介紹一種zui常用的方法：  
堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒dna的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析。方法如下：  
1、接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2mllb培養(yǎng)基。  
2、37℃振蕩培養(yǎng)過夜。  
3、取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。  
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0)充分混合。  
5、加入0.2ml溶液II(0.2mM/LNaOH，1％SDS)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min。  
6、加入0.15m1預(yù)冷溶液III(5mol/LKAc，pH4.8)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min。  
7、以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管  
8、加入等體積的異戊醇，混勻后于?0℃靜置10min。  
9、再以10，000rpm離心20min，棄上清。  
10、用70％乙醇0．5ml洗滌一次，抽干所有液體。  
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE緩沖液中  
煮沸法  
1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ離心30秒。  
2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。  
3、將菌體沉淀懸浮于120mlSTET溶液中,渦旋混勻。  
4、加入10ml新配制的溶液(10mg/ml),渦旋振蕩3秒鐘。  
5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。  
6、用微量離心機(jī)4℃下12000g離心10分鐘。  
7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。  
8、取20ml進(jìn)行電泳檢查。