TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（顯色法）

【資料簡(jiǎn)介】

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(顯色法)（石蠟切片）  
Cat  Number：BA2150 
Specification：50 次 
Store at: -20℃ for one year                                                          
MADE BY BIOBOX 
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 (顯色法)（石蠟切片） 
一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介 
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)為您提供了一種高靈敏度又快速簡(jiǎn)便
的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法。對(duì)于待檢測(cè)的細(xì)胞或組織樣品，經(jīng)過(guò)*標(biāo)記和后續(xù)的 DAB 顯色等步驟，即可在普通
光學(xué)顯微鏡檢測(cè)到凋亡的細(xì)胞。 
細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提
DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)180-200bp 的DNA ladder?；蚪MDNA 斷裂時(shí)，暴露的3’-OH可以在末端脫氧
核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上*(Biotin)標(biāo)記的dUTP(Biotin-dUTP)，
隨后和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)結(jié)合，zui后在HRP的催化下通過(guò)DAB顯色來(lái)
顯示凋亡細(xì)胞，從而可以通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)到凋亡的細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有 DNA
的斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被標(biāo)記。這就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測(cè)細(xì)
胞凋亡的原理。 
本試劑盒適用于石蠟包埋組織樣本的凋亡原位檢測(cè)。 
本試劑盒有如下優(yōu)點(diǎn)： 
1、 高靈敏度：可以在單細(xì)胞水平檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，同時(shí)由于凋亡早期就有DNA斷裂，可以檢測(cè)到早期的細(xì)
胞凋亡。 
2、 操作簡(jiǎn)便：使用Ready-to-Use型試劑，并配有蛋白酶 K  和DAB。 
3、 特異性：TUNEL檢測(cè)時(shí)通常更容易標(biāo)記凋亡細(xì)胞，而不容易標(biāo)記壞死細(xì)胞。 
4、 快速：僅需約3個(gè)小時(shí)即可完成。 
5、 方便觀察：使用光學(xué)顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無(wú)需貴重設(shè)備。 
二、試劑盒組份 
組   份  Cat: BA2120  Cat: BA2150  Cat: BA21100  儲(chǔ)存條件 
平衡液  1.0 mL  2.5 mL  5.0 mL  -20℃ 
TdT 酶  80μL  200μL  400μL  -20℃ 
50×蛋白酶 K  40μL  100μL  200μL  -20℃ 
Streptavidin-HRP  10μL  25μL  50μL  4℃避光 
Biotin-dUTP  20μL  50μL  100μL  -20℃ 
DAB  2mg   5mg   10 mg  -20℃避光
三、試劑盒以外自備儀器和試劑 
二甲苯、甲醇、乙醇、PBS、H2O2 
、TritonX-100、檸檬酸鈉、復(fù)染染液：蘇木素或甲基綠等； 
蓋玻片、載玻片、染色缸、染色濕盒、光學(xué)顯微鏡、37℃孵箱、移液器等。 
四、保存條件： 
-20℃保存，其中Streptavidin-HRP 4℃保存，Streptavidin-HRP和DAB需避光保存。 
五、注意事項(xiàng)： 
1、TUNEL法特異性檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生的DNA斷裂，但不會(huì)檢測(cè)出射線等誘導(dǎo)的DNA斷裂(和細(xì)胞凋亡時(shí)                                                                    
2 
的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和壞死區(qū)分開(kāi)，另一方面也不會(huì)把射線等誘導(dǎo)發(fā)生 DNA 斷裂的
非凋亡細(xì)胞判斷為凋亡細(xì)胞。 
2、極少數(shù)細(xì)胞凋亡時(shí)沒(méi)有 DNA 斷裂，此時(shí)不適用 TUNEL 法檢測(cè)。在個(gè)別類(lèi)型的壞死細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn) TUNEL
檢測(cè)呈陽(yáng)性。在需要嚴(yán)格判斷細(xì)胞凋亡的情況下，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)凋亡指標(biāo)。 
3、使用前請(qǐng)認(rèn)真閱讀本說(shuō)明書(shū)，提前準(zhǔn)備好相關(guān)試劑。 
4、因本試劑盒中組分均為微量，使用前請(qǐng)離心。 
5、為避免試驗(yàn)誤差、降低試劑的損耗，建議使用精密度高的進(jìn)口微量移液槍及槍頭。 
6、 TdT 酶反應(yīng)液在使用前根椐樣本數(shù)量集中配制，再分別滴加于各樣本片上，避免每個(gè)樣本單獨(dú)配制而
產(chǎn)生的試劑損耗。 
7、DAB為固體粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按說(shuō)明書(shū)顯色使用。 
8、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 
六、 操作規(guī)程 
A、 檢測(cè)樣本的預(yù)處理 
TUNEL檢測(cè)時(shí)樣本的預(yù)處理是試驗(yàn)的關(guān)鍵所在，本說(shuō)明書(shū)*的條件僅為普遍情況，用戶(hù)需根椐自已的樣 
本材料及試驗(yàn)結(jié)果來(lái)調(diào)整各個(gè)條件，如處理時(shí)間、處理濃度等，來(lái)優(yōu)化出適合自身樣本的試驗(yàn)條件，從而做
出客觀的試驗(yàn)結(jié)果。 
1、 對(duì)于常規(guī)石蠟切片 
a、  按常規(guī)方法將石蠟切片進(jìn)行脫蠟及水合 
  （如：二甲苯脫蠟2次，每次5-10 min；乙醇水合（將脫蠟好的的切片依次放入*乙醇、95%乙醇、
90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min）） 
b、 把a(bǔ)步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。 
c、  把b步處理好的樣本加入蛋白酶K工作液， 21-37℃作用15-30min。 
（蛋白酶K工作液的配制：2μL 50×蛋白酶 K＋98μL PBS） 
d、 把c步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。 
e、  把d步處理好的樣本浸入封閉液中，室溫（15-25℃）封閉10min。 
（封閉液的配制： 3%H2O2溶于甲醇） 
f、  把e步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次5min。 
g、 然后轉(zhuǎn)入B步驟標(biāo)記和顯色反應(yīng)。 
      注意事項(xiàng)： 
a、  蛋白酶K處理的使用濃度、處理時(shí)間及溫度，都因組織的類(lèi)型不同而有所不同，需要自已摸索優(yōu)化
上述條件，如有問(wèn)題，請(qǐng)根椐本說(shuō)明書(shū)的《常見(jiàn)問(wèn)題的原因及*解決方案》來(lái)調(diào)整條件。例如：
如果凋亡細(xì)胞染色較弱時(shí)，可用高濃度的蛋白酶K（400μg/mL）處理5分鐘。（本試劑盒的50×蛋
白酶K濃度為1mg/mL）。 
b、 其它替代方法：  石蠟切片的預(yù)處理也可根椐實(shí)際情況可采用下述三種替代方法之一，即蛋白酶K
處理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同： 
替代方法1:                                                                     
3 
 
將脫蠟及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%檸
檬酸鈉，需新鮮配制） 
替代方法2： 
  將脫蠟及水合好的切片浸入*或*中8-10 min（*溶液的配制：
0.25%-0.5%溶于HCl  PH2；*溶液的配制：0.25%-0.5%溶于0.01N HCl  ） 
替代方法3:  
  將脫蠟及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的檸檬酸緩沖液PH= 6 的塑料盒中，置于微波爐中
350W（低檔）處理5 min。為防止樣本脫落，請(qǐng)使用硅烷（Silane）處理的載玻片或采用多聚賴(lài)氨
酸鋪片。 
c、  使用酶處理切片時(shí)一定要把酶洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。 
2、 對(duì)于難處理的石蠟切片 
a、  按常規(guī)方法將石蠟切片進(jìn)行脫蠟及水合 
  （如：二甲苯脫蠟2次，每次5-10 min；乙醇水合（將脫蠟好的的切片依次放入*乙醇、95%乙醇、
90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min）） 
b、 把a(bǔ)步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次5min。 
c、  把b步處理好的樣本加入浸入含200ml 0.1M的檸檬酸緩沖液PH= 6 的塑料盒中，置于微波爐中750W
（）處理1 min。 
d、 迅速加入80ml雙蒸水（20-25℃）加入c步處理好切片的塑料盒中，冷卻至室溫， 將組織切片轉(zhuǎn)移至
PBS（20-25℃）中。 
e、  把d步處理好的樣本浸入封閉液中，室溫（15-25℃）封閉10min。 
 （封閉液的配制：  0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清） 
f、  把e步處理好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次10min。 
g、 然后轉(zhuǎn)入B步驟標(biāo)記和顯色反應(yīng)。 
     3、  陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照的準(zhǔn)備 
TUNEL檢測(cè)同時(shí)需要設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，以顯示試驗(yàn)的客觀性及準(zhǔn)確性。因此需要按下述方法準(zhǔn)備兩個(gè)
樣本來(lái)制備陽(yáng)性及陰性片，其后續(xù)步聚與待測(cè)樣本同樣進(jìn)行。 
        a、 陽(yáng)性對(duì)照樣本的準(zhǔn)備 
           組織樣本在蛋白酶K處理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反應(yīng)液（用戶(hù)自備）室溫—37℃處理
10 -30 min，其余步驟均相同。 
（DNase I反應(yīng)液的配制：10u-3000u DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2,
 
10mM CaCl2） 
b、 陰性對(duì)照樣本的準(zhǔn)備 
在標(biāo)記反應(yīng)的過(guò)程中不添加TdT酶反應(yīng)液，其余步驟均相同。 
B、 標(biāo)記和顯色反應(yīng)： 
1、 預(yù)處理好的樣本PBS漂洗 2 次，每次5min 后，樣本周?chē)脼V紙或吸水紙吸干。 
2、 配制TdT酶反應(yīng)液：                                                                    
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  參考下表配制適當(dāng)量的 TdT 酶反應(yīng)液（根據(jù)需要按照比例放大），需充分混勻。注意：配制好的 TdT
酶反應(yīng)液必須一次使用完畢，不能凍存。 
  1個(gè)樣品  5個(gè)樣品  10個(gè)樣品 
平衡液  45μl  225μl  450μl 
Biotin-dUTP  1μl  5μl  10μl 
TdT酶  4μl  20μl  40μl 
TdT酶反應(yīng)液總體積  50μl  250μl  500μl 
3、 每個(gè)樣本滴加50μL TdT酶反應(yīng)液，加蓋玻片37℃避光濕潤(rùn)反應(yīng)60min。（陰性對(duì)照片不加TdT酶） 
4、 把第3步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。 
5、  Streptavidin-HRP及DAB工作液的配制： 
  Streptavidin-HRP工作液的配制： 
參考下表配制適量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混勻。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必須
一次使用完畢，不宜凍存。 
  1個(gè)樣品  5個(gè)樣品  10個(gè)樣品 
Streptavidin-HRP  0.5μl  2.5μl  5μl 
PBS  99.5μl  497.5μl  995μl 
Streptavidin-HRP工作液總體積  100μl  500μl  1000μl 
DAB 工作液的配制： 
a、先把試劑盒中DAB粉末用PBS溶解配制成 20×DAB（10 mg/ml），配制方法如下： 
DAB  2mg  5mg  10mg 
PBS  0.2ml  0.5ml  1.0ml 
  配制成20×DAB（10 mg/ml），放于-20℃保存 
b、DAB工作液的配制： 
參考下表配制適量的DAB工作液，需充分混勻。注意：配制好的DAB工作液必須一次使用完畢，不宜凍存。  
  1個(gè)樣品  5個(gè)樣品  10個(gè)樣品 
20×DAB（10 mg/ml）  5μl  25μl  50μl 
30％H2O2  1μl  5μl  10μl 
PBS  94μl  470μl  940 
DAB工作液總體積  100μl  500μl  1000μl 
 
6、 將第5步處理好的樣本周?chē)脼V紙或吸水紙吸干，再滴加50μL-100μL Streptavidin-HRP工作液，加蓋玻
片37℃濕潤(rùn)避光反應(yīng)30min。 
7、 把第6步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min，樣本周?chē)脼V紙或吸水紙吸干。 
8、 將第7步處理好的樣本滴加50μL-100μL DAB工作液，室溫孵育5-30分鐘或根據(jù)顯色情況孵育適當(dāng)時(shí)間。
注意：如果顯色很強(qiáng)可以短于5分鐘即停止顯色，如果顯色很弱，可以適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間，甚至顯色過(guò)
夜。                                                                    
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9、 把第8步處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min，可直接光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。 
10、  選做(本步驟可不做)：用*或甲基綠染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色后用光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。 
具體的步驟請(qǐng)參照操作注意事項(xiàng)中的蘇木素復(fù)染 
操作注意事項(xiàng)： 
1、  PBS清洗后，為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請(qǐng)盡量除去PBS 溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。 
2、 在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn)行，這樣可以使
反應(yīng)液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失敗。 
3、  TdT酶反應(yīng)液即用即配，短暫于冰上保存。不宜*保存，*保存會(huì)導(dǎo)酶活性的失活。 
4、 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。 
5、 蘇木素復(fù)染：將切片放入蘇木素染液，染色 30min ，蒸餾水沖洗干凈后放入鹽酸甲醇溶液中 5s，
立即用蒸餾水沖洗干凈。分別用 70%、85%、95%、無(wú)水乙醇浸泡 5min。用二甲苯浸泡 10min，更換
二甲苯后再浸泡10min。晾干后在切片上加中性樹(shù)膠，加蓋玻片。 
 
七、常見(jiàn)問(wèn)題的原因及*解決方案 
現(xiàn)象  可能原因  建議 
 
非特異性
染色 
TdT酶的濃度過(guò)高  用TdT dilution buffer*  作1︰2—1︰10稀釋
TdT 酶反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或 TdT 酶反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)液
滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤(rùn)。 
注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保 TdT 酶反應(yīng)液能
很好地覆蓋樣品。 
光照紫外線導(dǎo)致包埋試劑的聚合（如：甲基丙烯酸
會(huì)導(dǎo)致樣本DNA的斷裂） 
嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑 
在固定組織時(shí)樣本DNA已斷裂（內(nèi)源核酸酶的作
用） 
確保樣品取樣后立即固定或通過(guò)肝靜脈灌注
固定 
使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?，例如一些酸性固定? 采用*的固定液 
固定后某些核酸酶活性依然較高導(dǎo)致DNA 斷裂  用含有dUTP和 dAPT 的溶液封閉 
 
標(biāo)記率低 
如果以乙醇或甲醇固定的樣本則標(biāo)記效率較低（因
為在固定時(shí)染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中
丟失） 
用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定 
或福爾馬林或戊二醛固定。 
固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致交聯(lián)程度過(guò)高 
減少固定時(shí)間，或用溶于PBS PH7.4的2%多
聚甲醛固定 
熒光淬滅 
Fluorescence 在普通光照 10 分鐘就會(huì)嚴(yán)重淬
滅，需注意避光操作 
促滲條件不佳，以致于試劑不能到達(dá)靶分子或濃度
過(guò)低 
1、 增加通透劑促滲時(shí)間 
2、增加通透劑的作用溫度（15-25℃） 
3、優(yōu)化蛋白酶K的作用濃度和作用時(shí)間（如：
以400ug/ml 作用5min） 
4、0.1M的檸檬酸鈉70℃作用30min。 
選擇的染料不合適 
用溶于0.1M醋酸*的3-5%甲基綠
PH4.0，或蘇木素復(fù)染 
染色背景
很高 
支原體污染 
請(qǐng)使用支原體染色檢測(cè)試劑盒檢測(cè)是否為支
原體污染 
TdT酶的濃度過(guò)高或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 
用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀釋
或注意控制反應(yīng)時(shí)間 
紅細(xì)胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。 宜選擇其它細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。 
高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的
DNA斷裂。 
在非高增殖期取樣檢測(cè) 
DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)  減少DAB染色時(shí)間 
Biotin-dUTP的非特異性結(jié)合 
在TdT酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100
和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。 
陽(yáng)性對(duì)照
沒(méi)有信號(hào) 
DNase I的濃度過(guò)低 
1、  冷凍切片使用3u/ml的DNase I 
2、  石蠟切片使用 1500u/ml的DNase I   
3、  一般樣本使用10u/ml DNase I 
組織樣本
從載玻片
脫落 
組織樣本被酶從玻片消化下來(lái)  降低蛋白酶K 的處理時(shí)間 
6 
*TdT dilution buffer：100mM乙酸鉀（pH6.8）， 1 mM 2-mercaptoethanol， 50 % Glycerol