SDS法提取植物基因組DNA

【資料簡(jiǎn)介】

本方法由Dellaporta,Wood和Hicks(1983)的方法修改而成。其基本原理是研磨的組織細(xì)胞用熱的SDS裂解后，加入高濃度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖類雜質(zhì)，zui后用乙醇或異丙醇沉淀。
一 材料、試劑和儀器
1 材料 新鮮的組織材料或-80℃凍存的材料
2 試劑
(1)提取緩沖液
Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0）
EDTA 50mmol/L （pH8.0）
NaCl 500 mmol/L
滅菌后加β-巰基乙醇至10 mmol/L
(2)裂解液20%SDS
(3)高鹽溶液5mol/L KAc
(4) RNAseA 10mg/ml
(5) 異丙醇
(6)滅菌ddH2O或TE
3. 儀器: 離心機(jī)， 恒溫水浴, 臺(tái)式高速離心機(jī)，電泳裝置
二 實(shí)驗(yàn)程序
1取幼嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉(zhuǎn)移粉末到加有500μL提取液的離心管中,輕輕混勻。
2 向管中加入50μL20%SDS溶液，混勻，不可過于強(qiáng)烈震蕩以防基因組DNA斷裂 ，65℃保溫10min，并不時(shí)搖動(dòng)。
3 加入150μL 5mol/L KAc，混勻，置冰上20-30 min。
4 4℃,15 000rpm離心15min,轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中，加入0.7V的異丙醇，混勻，-20℃沉淀30 min 。
5 12 000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀，吹干后加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。
6 加入1/10體積的RNaseA，37℃保溫20min，除去RNA。
7 CI抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30 min 。12 000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀。
8 用400μL 70%乙醇洗一次后，吹干，加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。
9 電泳檢測(cè)完整性。

三、結(jié)果分析
1． 用紫外分光光度計(jì)在230nm、260nm、 280nm和310nm波長(zhǎng)分別讀數(shù)。其中260nm

用瓊脂糖凝膠電泳（0.8%）檢測(cè)核DNA的完整性(見圖2 )。

完整性好的基因組DNA應(yīng)是一條比23Kb滯后的電泳帶, 若降解則成為彌散狀。
電泳前緣為未除干凈的RNA。
2．如果DNA沉淀呈白色透明狀而且溶解后成粘稠狀，說明DNA含有較多的多糖類物質(zhì)，可以在取材前將植物放暗處24hr，以達(dá)到去除淀粉的目的。
3. DNA沉淀呈棕色，難以酶切
植物材料含有大量酚類化合物，與DNA共價(jià)結(jié)合，使DNA呈棕色，并抑制DNA的酶解反應(yīng)。為防止此情況出現(xiàn)，可在加入2 ×CTAB的同時(shí)加入2-5%的巰基乙醇，或者加入亞精胺(100μl DNA加5μl 0.1mol/L的亞精胺）。
4．DNA中含有多糖或鹽類
將DNA用乙醇或異丙醇沉淀出來，離心，沉淀用70%乙醇清洗兩次或更多次，吹干后重溶于TE中。（注意乙醇一定要吹干, 否則電泳點(diǎn)樣時(shí), 樣品上漂）
5．DNA已降解電泳條帶呈彌散狀
樣品降解可能有兩種情況：一是機(jī)械振動(dòng)過劇烈，二是操作過程中DNase污染。在提取DNA的各個(gè)操作過程中要避免劇烈振蕩，提取液及用品要高溫高壓滅菌。另外，使用Tip頭吸取過程中應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，Tip頭應(yīng)剪去Tip頭尖，避免反復(fù)凍融DNA。