如何進(jìn)行RNA的制備

【資料簡(jiǎn)介】

來(lái)源于任何細(xì)胞的RNA都可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶的作用拷貝成雙鏈DNA并克隆化，獲得相應(yīng)的于特定細(xì)胞來(lái)源的cdna文庫(kù)。因此，RNA制備的意義有兩個(gè)方面
* 獲得特定細(xì)胞來(lái)源的cDNA文庫(kù)，克隆目的基因
* 分析基因的表達(dá)，闡明基因調(diào)控的特性，了解從基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA的結(jié)構(gòu)，數(shù)量，水平及合成的速率
抑制rna酶活性的方法
1. 滅菌法：將RNA提取過(guò)程中的使用的器具進(jìn)行高溫滅菌處理（180 ºC，8h），溶液等在高壓下蒸汽滅菌15min（1.034 X 105 Pa)
2. 焦碳酸二乙酯（DEPC）抑制法：DEPC是RNA酶的強(qiáng)烈抑制劑，塑料或玻璃器皿在含0.1%的DEPC溶液中浸泡2h，然后以滅菌水淋洗數(shù)次，在100 ºC下干烤15min。
3. RNA酶抑制劑法：利用RNA酶蛋白質(zhì)抑制劑與RNA酶緊密結(jié)合防止其發(fā)揮酶活作用；利用氧釩核糖核苷復(fù)合物與RNA酶結(jié)合；利用硅藻土吸附RNA酶。
一、細(xì)菌RNA的制備
1．菌體培養(yǎng) 同上
2. 離心收集菌體菌體
經(jīng)離心（5000g，5min）后，懸浮于終止緩沖液中（200mM Tris-HCl，pH8.0; 20 mM EDTA; 20 mM Na2N3; 20 mM 金精三羧酸(ATA)）
3. 菌體裂解 
加入STET緩沖液(8% 蔗糖; 5% Triton X-100; 50mM EDTA; 50mM Tris-HCl pH 7.0)懸浮加入0.2 M 的VRC (0.2M和10 mM的氧釩核苷復(fù)合物)
4. RNA提取
加入0.5 V的振蕩1 min,0.5 V氯仿振蕩1 min,10 000 g, 10 min,水相加入1/10 V的NaAc, 2 V的無(wú)水乙醇10000 g, 10 min沉淀溶于0,2 M 的VRC,以酚-氯仿抽提兩次
5. RNA純化
重溶沉淀于DEPC(焦碳酸二乙酯)處理的水中,加入CsCl溶液,于室溫離心(200000 g,1 h)回收RNA沉淀,溶于DEPC處理的水中,加入1/10 V的3 M的NaAc, 2 V的乙醇,離心后
6．RNA的溶解
將RNA沉淀溶于水中
二、植物組織細(xì)胞RNA的制備
1.細(xì)胞處理: 將植物組織置于液氮中凍結(jié)，研成粉末，加入勻漿緩沖液，高速勻漿，后高速離心（20000g，10 min） 
2.RNA提取:上清液中加入皂土(4%),等體積的酚,低溫振蕩5min，200000 g, 10 min
3.重復(fù)該步驟一次
4.RNA沉淀: 于上清液中加入KAc至終濃度為0.2 M,加兩倍體積 的無(wú)水乙醇,于0oC 30 min，30000g,20 min
5．RNA的溶解：沉淀溶于水中或TE緩沖液
三、哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)RNA的制備
1．細(xì)胞培養(yǎng): 人工組織培養(yǎng)
2．細(xì)胞裂解：以含磷酸緩沖液（PBS）的生理鹽水洗細(xì)胞懸浮于預(yù)冷的溶胞緩沖液中，加入24%的蔗糖，1%的NP-40溶胞緩沖液
3．去蛋白： 加入Protease K，于37 ºC溫育30 min，酚抽提
4．去DNA：乙醇沉淀,懸浮于DNA消化液(DNase I, 0.2% SDS)
5. 沉淀RNA: 加入終濃度為0.3 M的NaAc, 2V 無(wú)水乙醇于-20 ºC 2 h, 離心收集RNA.
四、mRNA的分離提純—寡聚(dT)-纖維素柱法
上柱緩沖液：
20 mmol/L Tris-HCl (pH7.6)
0.5 mol/L NaCl
1 mmol/L EDTA (pH8.0)
0.1% 十二烷基肌氨酸鈉
洗脫緩沖液：
10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)
1 mmol/L EDTA (pH8.0)
0.05% SDS
寡聚(dT)-纖維素柱法提純mRNA的過(guò)程