總RNA分離純化標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）

【資料簡介】

主要儀器
研缽，恒溫水浴，旋渦振蕩器，冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)，
超低溫冰箱，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。

試劑
1．Trizol試劑（購自invitrogen公司）
2．焦碳酸二乙酯(DEPC)
3．氯仿（新開封）
4．異丙醇（新開封）
5．無RNAse滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（250℃ 3小時(shí)）裝蒸餾水，然后加入0.1%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。
6．75%乙醇：用DEPC處理后的水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于4℃冰箱。 

相關(guān)器皿的預(yù)處理
1．塑料制品的處理
盡可能使用無菌，一次性塑料制品，已經(jīng)標(biāo)明RNase-Free的塑料制品，如果沒有開封使用過通常沒有必要再次處理。對(duì)于國產(chǎn)塑料制品，原則上都必須處理方可使用。處理步驟如下：
1）在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.1%。注意：DEPC為劇毒物質(zhì)，活性很強(qiáng)，應(yīng)在通風(fēng)櫥中小心使用。
2）將需要處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通分櫥中室溫處理過夜。
4）將DEPC水溶液小心倒入廢液瓶中，用鋁箔封住含有已用DEPC水處理過的塑料制品的容器，高溫高壓蒸汽滅菌至少30 min。
5）在烘箱中用合適的溫度烘烤至干燥。置于干凈處備用。
2．玻璃和金屬制品
先用去離子水將器皿清洗干凈，晾干，用鋁箔包好，然后至烘箱中250℃烘烤3 小時(shí)以上。

操作步驟
*部分 勻漿
A 從組織中提取總RNA、
1）液氮研磨：組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按照每50~100mg組織加入1ml Trizol，轉(zhuǎn)入離心管進(jìn)行下步操作。
2）勻漿：用電動(dòng)勻漿器充分勻漿1~2min。注意，組織樣品體積不能超過Trizol體積的10%，否則勻漿效果會(huì)不好。
B 從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA
1）粘壁培養(yǎng)細(xì)胞：不需蛋白酶消化，先將培養(yǎng)基去除，然后直接將Trizol加入到培養(yǎng)瓶中消化、裂解細(xì)胞，Trizol體積按10cm2/ml的比例加入。
2）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞：直接離心收集細(xì)胞后用Trizol重懸、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106個(gè)動(dòng)物、植物或酵母細(xì)胞，或1×107個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。注意，在加入Trizol之前不能用其他緩沖液洗滌細(xì)胞，那樣會(huì)增加mRNA降解的可能性。另外，在裂解酵母或細(xì)菌細(xì)胞時(shí)可以借助勻漿器。
第二部分 相分離
1．勻漿組織加入Trizol后，室溫放置5min，使其充分裂解。注意：此時(shí)可以放入-70℃保存。
2．室溫，12000 r/min，離心5 min。取上清于一新管。
3．按照1ml Trizol加入200µl氯仿，用手振蕩混勻后室溫放置2~3 min。注意：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。
4．4℃，12000 r/min，離心15 min。小心吸取上層水相于一新管。注意：千萬不要吸取中間界面；若同時(shí)提取DNA和蛋白質(zhì)，則保留下層酚相存于4℃冰箱中，如只提取RNA，則棄下層酚相。
第三部分 RNA沉淀
5．按照1ml Trizol加入異丙醇0.5 ml，混勻，室溫放置5~10 min。
6．4℃，12000 r/min，離心15min。棄上清，RNA沉淀管底。注意：RNA沉淀在離心之前是不可見的，常常在離心管的邊緣或者底部形成凝膠狀小球。
第四部分 RNA洗滌