純化線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

【資料簡(jiǎn)介】

 

主要用途

 

純化線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)鈣黃綠素載入后離心處理或鈷淬滅技術(shù)，選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，而存在于或由線粒體釋放到線粒體外的熒光染料，即刻發(fā)生熒光去除或淬滅，來(lái)分析和觀察線粒體膜通道孔活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種純化線粒體膜通道孔活性（瞬時(shí)或開(kāi)放狀態(tài)）的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，活體檢測(cè)，分辨率高，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內(nèi)外膜成分構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)，線粒體內(nèi)容物通過(guò)膜通道孔釋放到胞漿中。膜通道孔的開(kāi)放，顯著改變線粒體的通透性。鈣離子過(guò)度進(jìn)入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開(kāi)放，而造成細(xì)胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失。鈣黃綠素-AM，又稱雙甲亞胺二乙酸鈉熒光素－乙酰氧基甲基酯【bis（bis-carboxymethyl amino methyl fluorescein）-acetoxymethyl ester】，作為熒光探針：*，適宜的分子量622kd，小于1.5kd；第二，幾乎不具有膜結(jié)合性；第三，不是線粒體酶的底物；第四，容易進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體。鈣黃綠素-AM進(jìn)入線粒體后，被內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生具有極性的熒光性強(qiáng)的鈣黃綠素，被線粒體俘獲。同時(shí)線粒體外的鈣黃綠素通過(guò)離心去除或受到其淬滅劑鈷離子的淬滅。一旦線粒體膜通道孔瞬時(shí)開(kāi)放，鈣黃綠素釋放出線粒體外，由于離心處理或被鈷離子淬滅。線粒體內(nèi)鈣黃綠素?zé)晒獾淖兓?，表明膜通道孔的開(kāi)放狀態(tài)。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

染色液（Reagent A） 微升

中和液（Reagent B） 毫升

保存液（Reagent C） 毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份

 

保存方式

 

保存染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶自備

 

黑色96孔板：用于線粒體熒光分析的容器

1.5毫升離心管：用于線粒體染色的容器

載波片/蓋玻片：用于線粒體樣品存放后熒光分析

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀線粒體

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于線粒體熒光分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于線粒體熒光定量分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 直接法

 

• 準(zhǔn)備好待測(cè)的純化線粒體樣品
• 移取100微升線粒體樣品（總量為0.2毫克）到1.5毫升離心管
• 加入xx微升染色液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘，避免光照
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升37℃預(yù)熱的保存液（Reagent C），混勻顆粒群
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去保存液（Reagent C）
• 小心加入xx微升37℃預(yù)熱的保存液（Reagent C），混勻顆粒群
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

（A）使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

1）移取10微升上述懸液到載波片上，蓋上蓋玻片 

2）激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)505nm――

綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)

 

• 或使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

1）移取100微升上述懸液到100微升比色杯或黑色96孔板

2）即刻放進(jìn)熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)505nm――

RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)

 

• 間接法

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，中和液（Reagent B）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升中和液（Reagent B），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備好待測(cè)的純化線粒體樣品
• 移取100微升線粒體樣品（總量為0.2毫克）到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升含有染色液（Reagent A）和中和液（Reagent B）的染色工作液，充分混勻 
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘，避免光照
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

 

• 使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片（每隔5分鐘檢測(cè)一次，持續(xù)30分鐘）

2）激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)505nm――綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)

 

• 或使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

1） 移取100微升上述懸液到100微升比色杯或黑色96孔板

2） 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀（每隔5分鐘檢測(cè)一次，持續(xù)30分鐘）：激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)505nm――RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)