酵母RNA的提制

【資料簡介】

一、目的：
學習和掌握從酵母中提制RNA 的原理和方法，從而加深對核酸性質(zhì)的認識。
二、原理：
提取和制備RNA 的首要問題是選RNA 含量高的材料。微生物是工業(yè)上大量生產(chǎn)核酸的原料，其中RNA 的提制以酵母zui為理想，因為酵母核酸中主要是RNA（2.67～10.0%），DNA 很少（0.03～0.516％），而且菌體容易收集，RNA 也易于分離。此外，抽提后的菌體蛋白質(zhì)（占干菌體的50%）仍具有很高的應用價值。
RNA 提制過程首先要使RNA 從細胞中釋放，并使它和蛋白質(zhì)分離，然后將菌體除去。再根據(jù)核酸在等電點時溶解度zui小的性質(zhì)，將pH 調(diào)至2.0～2.5，使RNA 沉淀，進行離心收集。然后運用RNA 不溶于有機溶劑乙醇的特性，以乙醇洗滌RNA 沉淀。提取RNA 的方法很多，在工業(yè)生產(chǎn)上常用的是稀堿法和濃鹽法。稀堿法利用細胞壁在稀堿條件下溶解，使RNA 釋放出來，這種方法提取時間短，但RNA 在稀堿條件下不穩(wěn)定，容易被堿分解；濃鹽法是在加熱的條件下，利用高濃度的鹽改變細胞膜的透性，使RNA 釋放出來，此法易掌握，產(chǎn)品顏色較好。使用濃鹽法提出RNA 時應注意掌握溫度，避免在20～70℃之間停留時間過長，因為這是磷酸二酯酶和磷酸單酯酶作用的溫度范圍，會使RNA 因降解而降低提取率。在90～100℃條件下加熱可使蛋白質(zhì)變性，破壞磷酸二酯酶和磷酸單酯酶，有利于RNA 的提取。
三、實驗材料、主要儀器和試劑
1．實驗材料
活性；pH0.5～5.0 的精密試紙；冰塊。
2．儀器
（1）藥物天平
（2）三角瓶（100mL）
（3）量筒（50mL）
（4）水浴鍋
（5）電爐
（6）試管木夾
（7）離心管
（8）離心機（4 000r/min）
（9）燒杯（250mL, 50mL, 10mL）
（10）滴管及玻棒
（11）吸濾瓶（500mL）
（12）布氏漏斗（60mm）
（13）表面皿（8cm）
（14）烘箱
（15）干燥器
（16）紫外可見分光光度計
3．試劑
（1）NaCl（化學純）
（2）6mol/L HCl
（3）95％乙醇（化學純）
四、操作步驟
1．提取
活性粉5g，倒入100mL 三角瓶中，加NaCl 5g，水50mL，攪拌均勻，置于沸水浴中提取1h。
2．分離
將上述提取液取出，立即用自來水冷卻，裝入大離心管內(nèi)，以3 500r/min 離心10min，使提取液與菌體殘渣等分離。
3．沉淀RNA
將離心得到的上清液傾于50mL 燒杯中，并置于放有冰塊的250mL 燒杯中冷卻，待冷至10℃以下時，用6mol/L HCl 小心地調(diào)節(jié)pH 至2.0～2.5。隨著pH 下降，溶液中白色沉淀逐漸增加，到等電點時沉淀量zui多（注意嚴格控制pH）。調(diào)好后繼續(xù)于冰水中靜置10min，使沉淀充分，顆粒變大。
4．抽濾和洗滌
上述懸浮液以3 000r/min 離心10min，得到RNA 沉淀。將沉淀物放在10mL 小燒杯內(nèi)，用95％的乙醇5～10mL 充分攪拌洗滌，然后在鋪有已稱重濾紙的布氏漏斗上用真空泵抽氣過濾，再用95％乙醇5～10mL 淋洗3 次。由于RNA 不溶于乙醇，洗滌不僅可脫水，使沉淀物疏松，便于過濾、干燥，而且可除去可溶性的脂類及色素等雜質(zhì)，提高了制品的純度。
5．干燥
從布氏漏斗上取下有沉淀物的濾紙，放在8cm 表面皿上，置于80℃烘箱內(nèi)干燥。將干燥后的RNA 制品稱重。
6．含量測定
稱取一定量干燥后的RNA 產(chǎn)品配制成濃度為10～50μg/mL 的溶液，在751 型分光光度計上測定其260nm 處的光密度值，按下式計算RNA 含量：
酵母RNA的提制
式中：OD260nm 為260nm 處的光密度值；L 為比色杯的光徑（cm）；0.024 為1mL 溶液含有1μg RNA 的光密度值。
五、結(jié)果計算
根據(jù)含量測定的結(jié)果按下式計算提取率：
酵母RNA的提制
六、思考題
1．RNA 提制中注意事項是什么？
參考答案
1．主要注意事項為：避開核酸酶作用的溫度范圍20～70℃，防止RNA 降解。同時在調(diào)pH 值時，一定要緩慢小心，且要在低溫下進行。此外，在抽濾洗滌時，要用乙醇洗滌，且不可用水洗，否則將導致RNA 部分溶解而造成損失，降低RNA 提取率。