小鼠免疫球蛋白M（IgM）ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)操作

【資料簡(jiǎn)介】

小鼠免疫球蛋白M(IgM)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

試劑盒使用說(shuō)明書

本試劑盒僅供研究使用。

藥品名稱：

通用名：小鼠免疫球蛋白M(IgM)酶聯(lián)免疫分析試劑盒

使用目的：

本試劑盒用于測(cè)定小鼠血清、血漿、或其它組織液中免疫球蛋白M(IgM)。

ELISA實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用間接法測(cè)定標(biāo)本中小鼠免疫球蛋白M(IgM)水平。用純化的抗-小鼠IgM抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入小鼠免疫球蛋白M，再與HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠免疫球蛋白M呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠免疫球蛋白，(IgM)濃度。

試劑盒組成

1	20倍濃縮洗滌液	20ml×1瓶	7	終止液	3ml×1瓶
2	酶標(biāo)試劑	3ml×1瓶	8	標(biāo)準(zhǔn)品（3.6 μg/ml）	0.5ml×1瓶
3	酶標(biāo)包被板	12孔×4條	9	標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液	1.5ml×1瓶
4	樣品稀釋液	3ml×1瓶	10	說(shuō)明書	1份
5	顯色劑A液	3ml×1瓶	11	封板膜	2張
6	顯色劑B液	3ml×1/瓶	12	密封袋	1個(gè)

標(biāo)本要求

1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2．待檢血清1：200稀釋：具體為在試管中先按1：20稀釋待檢血清（190μl樣品稀釋液中加10μl待檢血清，混勻），再按1：10稀釋待檢血清（取90μl的樣品稀釋液加10μl  1：20稀釋過(guò)的待檢血清，混勻即可）

3．不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

4．可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

操作步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在*、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為（2.4μg/ml，1.6μg/ml ，0.8μg/ml，0.4μg/ml， 0.2μg/ml）。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   
4. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

 

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

ELISA試劑盒注意事項(xiàng)

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，*使用排槍加樣。

1. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×1000）。
2. 嚴(yán)格按說(shuō)明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)

6．底物請(qǐng)避光保存。

7．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

10. 如與英文說(shuō)明書有異，以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)。

檢測(cè)范圍：

0.1μg/ml -3μg/ml

規(guī)格：

48人份/盒

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個(gè)月