組織培養(yǎng)細(xì)胞染色體制備

【資料簡(jiǎn)介】

組織細(xì)胞用于遺傳學(xué)分析zui常見(jiàn)的是體外培養(yǎng)的細(xì)胞株，多為惡性腫瘤細(xì)胞株，且呈貼壁生長(zhǎng)，僅小數(shù)細(xì)胞株為懸浮生長(zhǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞有來(lái)源易得、細(xì)胞分裂率高和染色體標(biāo)本制出清晰度高等優(yōu)點(diǎn)。組織細(xì)胞染色體制備的關(guān)鍵是掌握好體外細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，只有處在對(duì)數(shù)生的細(xì)胞才能出現(xiàn)較高的分裂相，所以積水仙素處理的時(shí)機(jī)及量是染色體標(biāo)本形態(tài)及分裂指數(shù)的關(guān)鍵。 
1、 實(shí)驗(yàn)材料 
培養(yǎng)液（PRMI 1640、M199、DMEM等），小牛血清、0.025%胰蛋酶、秋水仙素，刻度離心管，直吸管及彎頭吸管，培養(yǎng)瓶或皿、KCL、甲醇、冰乙酸、載玻片。 
2、 培養(yǎng)液配制 
培養(yǎng)液 85-95% 
小牛血清 5-15% 
雙抗（選擇） 100u/ml 
3、 操作過(guò)程 
（1）培養(yǎng)細(xì)胞：選擇處于指數(shù)生、用大瓶培養(yǎng)的80-90%匯合單層培養(yǎng)細(xì)胞； 
（2）終止培養(yǎng)：當(dāng)有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)，加秋水仙素0.01-0.03ug/ml培養(yǎng)混合液，置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6-10小時(shí)以抑制分裂期細(xì)胞停止于分裂中期；（3）聚集細(xì)胞： 
（A） 搖動(dòng)法： 
可利用分裂中期細(xì)胞變圓與底物附著不牢特點(diǎn)，此時(shí)可持培養(yǎng)瓶，左右反復(fù)橫向水平搖動(dòng)，可使90%的中期分裂細(xì)胞從瓶壁脫落； 
（B） 消化法： 
將培養(yǎng)液倒入離心管內(nèi)，給培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加0.025%液0.5-1ml/瓶，水平左右搖動(dòng)，便培養(yǎng)瓶底壁面*接觸消化酶，稍后用彎頭吸管吹打，待細(xì)胞*脫落后，加入3-5ml前培養(yǎng)終止消化。用吸管移入裝有培養(yǎng)液的離心管內(nèi)2000rpm10分鐘。棄上清液，留沉淀細(xì)胞； 
（4）低滲處理：給沉淀細(xì)胞加頂溫的37℃0.075MKCL8ml左右，用吸管打均勻，在溫箱中靜置20-30分鐘； 
（5）預(yù)固定：向低滲處理適當(dāng)?shù)碾x心管中加新鮮配制的3∶2甲醇，冰乙醇固定液1-2ml，用吸管輕松吹打調(diào)勻，此措施能起到使細(xì)胞表面輕微固定，可防止固定后細(xì)胞粘連成塊。 
（6）固定：800-1000rpm10分鐘，棄上清液加新鮮配制的3∶2甲醇冰乙酸固定液10ml，加入時(shí)要沿管壁慢慢加入，后輕輕吹打，封口后室溫靜置30分鐘以上，反復(fù)三次； 
（7）制片：末次離心后，倒掉上清液，留沉淀細(xì)胞，加新鮮配制固定液0.5ml左右，混勻后制片，其它同外周血方法。