Elisa樣本處理方法

【資料簡(jiǎn)介】

樣品前處理

腦組織

1.  聚集的Aβ（阿滋海默癥病人的腦組織）

①1g腦組織切碎后加5倍體積的TBS，用均質(zhì)器均質(zhì)（10次）。 組織勻漿500000×g，4℃離心20分鐘。

TBS：50 mmol/L Tris-HCl ,  pH 7.6, 150 mmol/L NaCl ,  蛋白酶抑制劑 [0.1 mmol/L 二異丙基氟磷酸鹽 , 0.5 mmol/L 苯甲磺酰氟 , 1 g/mL甲苯磺酰-L-賴氨酸氯甲基酮鹽酸鹽, 1 g/mL抗痛素, 0.1 g/mL亮肽素]

②沉淀物懸浮與5倍體積的TBA/蛋白酶抑制劑（含1 mol/L蔗糖），500000×g，4℃離心20分鐘。

③沉淀物中加入3倍體積的1％Triton X-100/TBS/蛋白酶抑制劑，勻質(zhì)（10次）。37℃孵育15分鐘后，500000×g離心20分鐘。

④沉淀物和勻質(zhì)物中加入3倍體積的2％SDS/TBS/蛋白酶抑制劑到。組織勻漿37℃孵育15分鐘后，500000×g 25℃離心。

⑤沉淀物中加1mL 70％蟻酸到，超聲破碎后500000×g 4℃離心

⑥收集上清液并用離心濃縮（Speed Vac）干燥。加100μL DMSO并短時(shí)超聲破碎成懸液。零下80℃儲(chǔ)存這個(gè)DMSO－蟻酸溶解的Aβ溶液直到使用。

⑦檢測(cè)時(shí)，依照說(shuō)明書所寫，用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液溶解樣本。推薦稀釋度是Aβ40稀釋1,000倍，Aβ42稀釋100倍。

2. 可溶Aβ（正常腦組織）

2-1. 使用70％蟻酸

①150mg組織加入1mL 70％蟻酸中勻質(zhì)（敲6次）后100,000×g離心1小時(shí)。

②用1 mol/L Tris二十倍稀釋上清液

③用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋樣品后，按照說(shuō)明書所述方法檢測(cè)。

2-2. 使用5.0 mol/L鹽酸胍

①組織加入10倍體積預(yù)冷的L鹽酸胍溶液（5.0 mol/L / 50 mmol/L Tris-Cl, pH8.0）后勻質(zhì)，室溫下3～4小時(shí)。

②組織勻漿中加入10倍體積的預(yù)冷酪蛋白緩沖劑（0.25%干酪素/  0.05% */ 20μg/ml*/ 5 mmol/l EDTA, pH8.0 / 10μg/mL亮肽素，溶于PBS），16,000×g，4℃離心20分鐘。

③用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋上清液后，按照說(shuō)明書所述方法檢測(cè)。

細(xì)胞培養(yǎng)上清液

根據(jù)需要用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋樣品，然后按照說(shuō)明書所述方法檢測(cè)。推薦稀釋濃度是Aβ40稀釋5倍，Aβ42無(wú)需稀釋。

腦脊液

根據(jù)需要用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋樣品，然后按照說(shuō)明書所述方法檢測(cè)。推薦稀釋濃度是50倍。

血漿

①用EDTA2K離心收集在真空血液收集管中的血液，5,000×g，15分鐘，4℃，分離血漿樣品，然后儲(chǔ)存在零下80℃直到使用。

②用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液4倍稀釋血漿以避免血漿中的干擾物質(zhì)影響檢測(cè)，按照說(shuō)明書方法檢測(cè)。