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真菌/酵母細胞線粒體損傷/氧化熒光測定試劑盒實驗步驟
2015-9-15 閱讀(556)
真菌/酵母細胞線粒體損傷/氧化熒光測定試劑盒實驗步驟：
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，將染色工作液置入暗室里。同時開啟熒光顯微鏡或熒光光度儀。然后進行下列操作。
活體染色
- 準備好1毫升新鮮的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 107細胞/毫升）
- 移入到1.5毫升離心管
- 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻
- 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 重復實驗步驟5至7一次
- 加入xx毫升上述配制的染色工作液，充分混勻（注意：參見注意事項6）
- 放進20℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
- 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻
- 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 加入xx微升預冷的清理液（Reagent A），混勻
- 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察（定性檢測）：
- 移出5微升在載玻片上，放上蓋玻片
- 即刻進行載玻片壓片（選擇下列其中一種）
（A）激發(fā)波長580nm，散發(fā)波長630nm
紅光減弱，表明活性氧族含量高，脂類物質降解，線粒體質重降低（線粒體損傷或氧化）
（B）激發(fā)波長495nm，散發(fā)波長519nm
綠光減弱或降低，表明活性氧族含量高，脂類物質降解，線粒體質重降低（線粒體損傷或氧化）
- 或使用熒光分光光度儀
- 移取500微升染色后的細胞樣品到用戶自備的1毫升比色皿
- 加入xx微升清理液（Reagent A）
- 上下傾倒混勻
- 即刻放進熒光分光光度儀測讀：濾波器激發(fā)波長580nm，散發(fā)波長630nm或濾波器激發(fā)波長495nm，散發(fā)波長519nm：活性氧族含量高，脂類物質降解，線粒體質重降低（線粒體損傷或氧化）――相對熒光單位（RFU）降低
- 固定染色
- 準備好1毫升新鮮的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 107細胞/毫升）
- 加入到1.5毫升離心管
- 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻
- 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 重復實驗步驟5至7一次
- 加入xx毫升－20℃預冷的固著液（Reagent D），混勻
- 放進－20℃冰箱里孵育20分鐘
- 加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻
- 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 重復實驗步驟11至13二次
- （選擇步驟）置于100瓦超聲儀下，功率20％，猝擊5秒一次（分離集聚一起的細胞）
- 加入xx毫升上述配制的染色工作液，充分混勻（注意：參見注意事項6）
- 放進20℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
- 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻
- 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 加入xx微升預冷的清理液（Reagent A），混勻
- 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察（定性檢測）：
- 移出5,微升在載玻片上，放上蓋玻片
- 即刻進行載玻片壓片（選擇下列其中一種）
（A）激發(fā)波長580nm，散發(fā)波長630nm
紅光減弱，表明活性氧族含量高，脂類物質降解，線粒體質重降低（線粒體損傷或氧化）
（B）激發(fā)波長495nm，散發(fā)波長519nm
綠光減弱或降低，表明活性氧族含量高，脂類物質降解，線粒體質重降低（線粒體損傷或氧化）
- 或使用熒光分光光度儀
- 移取500微升染色后的細胞樣品到用戶自備的1毫升比色皿
- 加入xx微升清理液（Reagent A）
- 上下傾倒混勻
- 即刻放進熒光分光光度儀測讀：濾波器激發(fā)波長580nm，散發(fā)波長630nm或濾波器激發(fā)波長495nm，散發(fā)波長519nm：活性氧族含量高，脂類物質降解，線粒體質重降低（線粒體損傷或氧化）――相對熒光單位（RFU）降低
