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上海哈靈生物科技有限公司
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通用型DNA損傷彗星檢測試劑盒產(chǎn)品說明書
2015-9-15 閱讀(581)
通用型DNA損傷彗星檢測試劑盒?主要用途
通用型DNA損傷彗星檢測試劑是一種旨在采用組織細胞堿性凝膠電泳，在電場環(huán)境下，損傷變性的DNA片段遷移形成特定的形態(tài)，即DNA移動尾巴，來進行體外評價和半定量分析DNA損傷程度的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于新鮮動物細胞、組織、血液、骨髓等樣品的DNA損傷研究，包括DNA鏈斷裂、氧化性堿基損傷、DNA剪切損傷、DNA交聯(lián)、DNA修復等，應用于環(huán)境和藥物毒理學、放射學、氧化應急反應等研究。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡便，重復一致。
技術背景
彗星檢測技術（Comet assay），又稱為單細胞凝膠電泳檢測技術（single cell gel electrophoresis assay；SCGE）或微凝膠電泳檢測技術（microgel electrophoresis assay），是基于變性切離的DNA片段，在電場的影響下，從細胞中移出的原理，而完整的超螺旋DNA仍然保持在細胞核內(nèi)。通過凝膠電泳，呈現(xiàn)出分子遷移圖形，形成彗星拖尾（comet tail）現(xiàn)象，即完整DNA的細胞染色體為“頭"，而松散和斷裂的DNA為“尾"，以此評價DNA損傷程度。這是分析單一細胞DNA鏈斷裂的敏感方法之一。其技術方法的基本步驟是：*，細胞固定包埋在凝膠里；第二，細胞裂解處理；第三，DNA變性處理；第四，電泳遷移；第五，染色和圖像分析。由此觀察DNA遷移形態(tài)，進行體外檢測，成為細胞DNA損傷研究的基本手段。其中電泳條件將決定檢測的敏感程度。堿性電泳（alkaline electrophoresis）為常規(guī)電泳檢測，可以檢測單鏈DNA斷裂、雙鏈DNA斷裂、大部分無嘌呤核酸位點（apurinic site）和無嘧啶核酸位點（apyrimidic site）、堿不穩(wěn)定DNA結合物（alkali-labile DNA adduct）等DNA損傷。
產(chǎn)品內(nèi)容
膠體液（Reagent A） 毫升
基質(zhì)液（Reagent B） 毫升
清理液（Reagent C） 毫升
裂解液（Reagent D） 毫升
電泳液（Reagent E） 500毫升（用戶自備）
中和液（Reagent F） 200毫升（用戶自備）
染色液（Reagent G） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存染色液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
用戶自備
無離子水：用于稀釋電泳緩沖液
磨砂載玻片和蓋玻片：用于放置樣品進行微凝膠電泳的器材
電泳槽：用于微凝膠電泳的裝置
恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于孵育反應
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
90 mm培養(yǎng)皿：用于樣品處理、染色等的容器
熒光顯微鏡：用于觀察細胞彗星現(xiàn)象
實驗步驟
一、 瓊脂載玻片準備
1． 準備1張磨砂載玻片，磨砂面朝上
2． 將膠體液（Reagent A）置于微波爐里加熱溶化（注意：避免溢出）
3． 放進40℃恒溫水槽孵育10分鐘
4． 移出xx微升膠體液（Reagent A）到載玻片中間
5． 蓋上潔凈的蓋玻片
6． 輕壓蓋玻片5分鐘
7． 放進4℃冰箱里備用
二、 樣品準備
實驗開始前，將基質(zhì)液（Reagent B）置于微波爐里加熱溶化，然后放進40℃恒溫水槽備用。然后進行下列操作。
1． 準備好新鮮培養(yǎng)細胞、組織樣本、血液樣品等 （1 X 105細胞）
2． 移入到1.5毫升離心管
3． 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
4． 加入xx毫升清理液（Reagent C），混勻
5． 移取20微升到新的1.5毫升離心管
6． 加入xx微升在40℃恒溫水槽里的基質(zhì)液（Reagent B）
7． 用槍頭上下抽吸混勻
8． 用大拇指推動移走上述制備的載玻片上的蓋玻片
9． 即刻移取75微升細胞基質(zhì)混合液到載玻片上
10． 用新的蓋玻片蓋上
11． 輕壓蓋玻片5分鐘
12． 放進4℃冰箱里冷卻10分鐘，直至膠體凝結，避免光照
13． 用大拇指推動移走蓋玻片
14． 將載玻片放進9cm培養(yǎng)皿
15． 加入xx毫升預冷的裂解液（Reagent D）
16． 放進4℃冰箱里孵育60分鐘
17． 倒去裂解液
三、 凝膠電泳
1． 移出xx毫升電泳液（Reagent E）到250毫升三角燒瓶里
2． 加入225毫升無離子水，充分混勻后，標記為電泳工作液
3． 加入xx毫升電泳工作液到上述9cm培養(yǎng)皿
4． 室溫下孵育30分鐘
5． 倒去電泳工作液
6． 將載玻片置于（具有溫度控制的）水平電泳槽里
7． 加入適量的電泳工作液到電泳槽里，恰好在載玻片之上
8． 插上電源，設定電壓25伏或電流300毫安
9． 在4℃環(huán)境下，電泳30分鐘
10． 斷開電源，取出載玻片
11． 放進無離子水里浸潤2次，每次1秒
12． 放進9cm培養(yǎng)皿
13． 加入xx毫升中和液（Reagent F）
14． 在4℃冰箱里孵育5分鐘
15． 倒去中和液
16． 空氣中晾干
