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通用型DNA損傷彗星檢測試劑盒?主要用途

通用型DNA損傷彗星檢測試劑是一種旨在采用組織細(xì)胞堿性凝膠電泳，在電場環(huán)境下，損傷變性的DNA片段遷移形成特定的形態(tài)，即DNA移動尾巴，來進(jìn)行體外評價和半定量分析DNA損傷程度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于新鮮動物細(xì)胞、組織、血液、骨髓等樣品的DNA損傷研究，包括DNA鏈斷裂、氧化性堿基損傷、DNA剪切損傷、DNA交聯(lián)、DNA修復(fù)等，應(yīng)用于環(huán)境和藥物毒理學(xué)、放射學(xué)、氧化應(yīng)急反應(yīng)等研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡便，重復(fù)一致。

技術(shù)背景

彗星檢測技術(shù)（Comet assay），又稱為單細(xì)胞凝膠電泳檢測技術(shù)（single cell gel electrophoresis assay；SCGE）或微凝膠電泳檢測技術(shù)（microgel electrophoresis assay），是基于變性切離的DNA片段，在電場的影響下，從細(xì)胞中移出的原理，而完整的超螺旋DNA仍然保持在細(xì)胞核內(nèi)。通過凝膠電泳，呈現(xiàn)出分子遷移圖形，形成彗星拖尾（comet tail）現(xiàn)象，即完整DNA的細(xì)胞染色體為“頭"，而松散和斷裂的DNA為“尾"，以此評價DNA損傷程度。這是分析單一細(xì)胞DNA鏈斷裂的敏感方法之一。其技術(shù)方法的基本步驟是：*，細(xì)胞固定包埋在凝膠里；第二，細(xì)胞裂解處理；第三，DNA變性處理；第四，電泳遷移；第五，染色和圖像分析。由此觀察DNA遷移形態(tài)，進(jìn)行體外檢測，成為細(xì)胞DNA損傷研究的基本手段。其中電泳條件將決定檢測的敏感程度。堿性電泳（alkaline electrophoresis）為常規(guī)電泳檢測，可以檢測單鏈DNA斷裂、雙鏈DNA斷裂、大部分無嘌呤核酸位點(diǎn)（apurinic site）和無嘧啶核酸位點(diǎn)（apyrimidic site）、堿不穩(wěn)定DNA結(jié)合物（alkali-labile DNA adduct）等DNA損傷。

產(chǎn)品內(nèi)容

膠體液（Reagent A） 毫升

基質(zhì)液（Reagent B） 毫升

清理液（Reagent C） 毫升

裂解液（Reagent D）     毫升

電泳液（Reagent E）     500毫升（用戶自備）

中和液（Reagent F）     200毫升（用戶自備）

染色液（Reagent G） 毫升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存染色液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月 

用戶自備

無離子水：用于稀釋電泳緩沖液

磨砂載玻片和蓋玻片：用于放置樣品進(jìn)行微凝膠電泳的器材

電泳槽：用于微凝膠電泳的裝置

恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

90 mm培養(yǎng)皿：用于樣品處理、染色等的容器

熒光顯微鏡：用于觀察細(xì)胞彗星現(xiàn)象

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 瓊脂載玻片準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備1張磨砂載玻片，磨砂面朝上

2． 將膠體液（Reagent A）置于微波爐里加熱溶化（注意：避免溢出）

3． 放進(jìn)40℃恒溫水槽孵育10分鐘

4． 移出xx微升膠體液（Reagent A）到載玻片中間

5． 蓋上潔凈的蓋玻片

6． 輕壓蓋玻片5分鐘

7． 放進(jìn)4℃冰箱里備用

二、 樣品準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)開始前，將基質(zhì)液（Reagent B）置于微波爐里加熱溶化，然后放進(jìn)40℃恒溫水槽備用。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備好新鮮培養(yǎng)細(xì)胞、組織樣本、血液樣品等 （1 X 105細(xì)胞）

2． 移入到1.5毫升離心管 

3． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g

4． 加入xx毫升清理液（Reagent C），混勻

5． 移取20微升到新的1.5毫升離心管

6． 加入xx微升在40℃恒溫水槽里的基質(zhì)液（Reagent B）

7． 用槍頭上下抽吸混勻

8． 用大拇指推動移走上述制備的載玻片上的蓋玻片

9． 即刻移取75微升細(xì)胞基質(zhì)混合液到載玻片上

10． 用新的蓋玻片蓋上

11． 輕壓蓋玻片5分鐘

12． 放進(jìn)4℃冰箱里冷卻10分鐘，直至膠體凝結(jié)，避免光照

13． 用大拇指推動移走蓋玻片

14． 將載玻片放進(jìn)9cm培養(yǎng)皿

15． 加入xx毫升預(yù)冷的裂解液（Reagent D）

16． 放進(jìn)4℃冰箱里孵育60分鐘

17． 倒去裂解液

三、 凝膠電泳

1． 移出xx毫升電泳液（Reagent E）到250毫升三角燒瓶里 

2． 加入225毫升無離子水，充分混勻后，標(biāo)記為電泳工作液

3． 加入xx毫升電泳工作液到上述9cm培養(yǎng)皿

4． 室溫下孵育30分鐘

5． 倒去電泳工作液

6． 將載玻片置于（具有溫度控制的）水平電泳槽里

7． 加入適量的電泳工作液到電泳槽里，恰好在載玻片之上

8． 插上電源，設(shè)定電壓25伏或電流300毫安

9． 在4℃環(huán)境下，電泳30分鐘

10． 斷開電源，取出載玻片

11． 放進(jìn)無離子水里浸潤2次，每次1秒

12． 放進(jìn)9cm培養(yǎng)皿

13． 加入xx毫升中和液（Reagent F）

14． 在4℃冰箱里孵育5分鐘

15． 倒去中和液

16． 空氣中晾干