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上海哈靈生物科技有限公司
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冰凍切片組織線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測試劑盒說明書
2016-3-15 閱讀(1526)
主要用途
冰凍切片組織線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測試劑是一種旨在通過鈣黃綠素-鈷技術(shù)，選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，而存在于或由線粒體釋放到細(xì)胞漿的熒光染料，即刻發(fā)生熒光淬滅，來分析和觀察線粒體膜通道孔活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種冰凍組織線粒體（動物、人體、昆蟲等）膜通道孔活性的檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，分辨率高，操作簡捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內(nèi)外膜成分構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)，線粒體內(nèi)容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。膜通道孔的開放，顯著改變線粒體的通透性。鈣離子過度進(jìn)入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開放，而造成細(xì)胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失。鈣黃綠素-AM，又稱雙甲亞胺二乙酸鈉熒光素-乙酰氧基甲基酯【bis（bis-carboxymethyl amino methyl fluorescein）-acetoxymethyl ester】，作為熒光探針：*，適宜的分子量622d，小于1.5kd；第二，幾乎不具有膜結(jié)合性；第三，不是線粒體酶的底物；第四，容易進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體。鈣黃綠素-AM進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生具有極性的熒光性強(qiáng)的鈣黃綠素。鈣黃綠素進(jìn)入線粒體后，被線粒體俘獲。同時(shí)胞漿內(nèi)的鈣黃綠素受到其淬滅劑鈷離子的淬滅。一旦線粒體膜通道孔瞬時(shí)開放，鈣黃綠素釋放出來，被鈷離子淬滅。線粒體內(nèi)鈣黃綠素?zé)晒獾淖兓?，表明膜通道孔的開放狀態(tài)。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
染色液（Reagent B） 微升
中和液（Reagent C） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于染色工作液配制和組織細(xì)胞染色的容器
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于組織細(xì)胞熒光分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，中和液（Reagent C）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升中和液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。
- 準(zhǔn)備5片待測的厚為10微米的未經(jīng)固著處理的冰凍切片
- 置于室溫下，小心加上xx微升預(yù)冷的清理液（Reagent A），鋪滿整個(gè)切片表面
- 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
- 小心加上xx微升室溫預(yù)熱的染色工作液，鋪滿整個(gè)切片表面
- 在37℃濕潤培養(yǎng)箱里，孵育30至60分鐘（注意：避免液體蒸發(fā)）
- 小心移去切片上的染色工作液，避免光照
- 小心加上xx微升清理液（Reagent A），鋪滿整個(gè)切片表面
- 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
- 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟7和8一次
- 放上蓋玻片或封片
- 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察（定性檢測）：激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長505nm――綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)
注意事項(xiàng)
- 本產(chǎn)品為50次操作
- 操作時(shí)，避免污染母液
- 操作時(shí)，須戴手套
- 建議使用新鮮組織（手術(shù)切除后1小時(shí)內(nèi)）制成的冰凍切片
- 染色前，所有試劑溶液，除染色液（Reagent B）外，需37℃預(yù)熱
- 建議組織染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析
- 孵育時(shí)，必須避免光照
- 本產(chǎn)品友好使用于雙重染色或重疊染色
- 如果不具備505nm散發(fā)波長的濾波器，可以使用505nm至530nm中的任一波長
- 本公司提供膜通道孔抑制劑： 0.2毫摩爾環(huán)胞素A（cyclosporine A）－12226，維護(hù)熒光完整
- 本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰
