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植物磷脂酶C（Phospholipase C）活性酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)比色法定量檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

主要用途

植物磷脂酶C（Phospholipase C）活性酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)磷脂酶C、堿性磷酸酶、膽堿氧化酶和過(guò)氧化酶酶連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)中，在磷脂酶C抑制劑的存在下，所產(chǎn)生的紅色產(chǎn)物醌亞胺染料，在分光光度儀下峰值的增高，即采用比色法來(lái)測(cè)定組織裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）或微粒體樣品等磷脂酶C的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

磷脂酶（phospholipase），是一種脂質(zhì)水解酶，催化磷脂的水解，產(chǎn)生脂肪酸和其它親脂產(chǎn)物，參與磷脂代謝。磷脂酶家屬有四種類型亞酶，包括A、B、C和D。磷脂酶A（phospholipase A；PLA）主要水解磷脂sn-1（磷脂酶A1催化）和sn-2（磷脂酶A2催化）位置上的乙?；?；磷脂酶B（phospholipase B；PLB）同時(shí)水解磷脂的sn-1和sn-2位置上的乙?；址Q為溶血磷脂酶（lysophospholipase）；磷脂酶C（phospholipase C；PLC；EC3.1.4.3）在磷酸基前（即磷酸和甘油之間）水解，釋放二酰基甘油（diacylglycerol；DAG）和第二信使分子三磷酸肌醇（inositol triphosphate）；磷脂酶D（phospholipase D；PLD）在磷酸基后水解，釋放磷脂酸（phosphatidic acid）。哺乳動(dòng)物磷脂酶D，又稱為磷脂酰膽堿磷脂酸水解酶（Phosphatidylcholine phosphatidohydrolase），有2個(gè)異構(gòu)體：磷脂酶D1和D2，存在于細(xì)胞質(zhì)膜上。磷脂酶C，又稱為卵磷脂酶（lecithinase）或α-毒素（α-toxin），在細(xì)菌培養(yǎng)液上清中存在，具有水解生物膜上的卵磷脂（lecithin），因此會(huì)產(chǎn)生溶血、皮膚壞死性（dermonecrotic）和致命作用。磷脂酶C還可以水解鞘磷脂（sphingomylin），腦磷脂（phosphatidylethanolamine）等。在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路上起著重要作用。植物磷脂酶C受到鈣離子調(diào)節(jié)，在生物性或非生物性壓力中發(fā)揮作用。其次通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)信號(hào)通路中，控制花粉管生長(zhǎng)和植物發(fā)育?；诘孜锫蚜字╨ecithin），在磷脂酶C選擇性抑制劑U73122存在與否的情況下，通過(guò)磷脂酶C的作用，水解產(chǎn)生為二酰基甘油和磷酸膽堿（choline phosphate），進(jìn)而由堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）去磷酸化產(chǎn)生膽堿（choline），后通過(guò)膽堿氧化酶（choline oxidase）和過(guò)氧化酶（peroxidase）系統(tǒng)，測(cè)定紅色產(chǎn)物醌亞胺染料（quinoneimine dye）的峰值變化（500nm 波長(zhǎng)），來(lái)定量分析磷脂酶C的活性。其連續(xù)循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)為：

PLC 

Leicithin  +  H2O     →      Diacylglycerol  +  Choline phosphate

 Alkaline phosphatase 

Choline phosphate  +  H2O     →      Choline  +  Phosphate

choline oxidase

Choline  +  O2  +  H2O  → Betaine aldehyde  +  2 H2O2

            peroxidase

 2 H2O2  +  4-Aminoantipyrine  +  Phenol     →    2 H2O  +   Quinoneimine dye   

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 30毫升

裂解液（Reagent B） 10毫升

緩沖液（Reagent C）   5毫升

反應(yīng)液（Reagent D） 600微升

酶促液（Reagent E） 600微升

底色液（Reagent F） 600微升

陰性液（Reagent G） 600微升

專性液（Reagent H） 100微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃，其余的保存－20℃冰箱里；底色液（Reagent F）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存和反應(yīng)操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、樣品準(zhǔn)備

1．準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定200至500毫克組織重量 

2．（選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3．（選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4．即刻用刀片切碎組織

5．放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

6．加入預(yù)冷的1毫升裂解液（Reagent B）

7．渦旋震蕩5秒，充分混勻

8．即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）

9．將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

10．小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

11．（選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見(jiàn)的殘?jiān)?，重?fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

12．放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

13．小心移取1毫升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

14．（選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心60分鐘，速度為105000g 

15．（選擇步驟）小心移取1毫升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

16．移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30031.1）

17．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測(cè)定準(zhǔn)備

1．開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀或酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)500nm，并置零 

2．從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent F）避免光照

3．緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、背景對(duì)照測(cè)定

1．移取170微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿或96孔板

2．加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）

3．加入10微升陰性液（Reagent G）

4．在37℃溫度下孵育10分鐘

5．加入25微升酶促液（Reagent E）

6．加入20微升底色液（Reagent F）

7．上下傾倒數(shù)次，混勻 

8．在37℃溫度下孵育30分鐘，避免光照

9．即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照 

四、樣品總活性測(cè)定

1．移取170微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿或96孔板

2．加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）

3．加入10微升待測(cè)樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

4．渦旋震蕩5秒

5．在37℃溫度下孵育10分鐘

6．加入25微升酶促液（Reagent E）

7．加入20微升底色液（Reagent F）

8．上下傾倒數(shù)次，混勻

9．在37℃溫度下孵育30分鐘，避免光照

10．即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)  

五、樣品非特異活性測(cè)定

1．移取160微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿或96孔板

2．加入10微升專性液（Reagent H）

3．加入10微升待測(cè)樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

4．在37℃溫度下孵育15分鐘

5．加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）

6．在37℃溫度下孵育10分鐘

7．加入25微升酶促液（Reagent E）

8．加入20微升底色液（Reagent F）

9．上下傾倒數(shù)次，混勻

10．在37℃溫度下孵育30分鐘，避免光照

11．即刻放進(jìn)分光光度儀或酶標(biāo)儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)

六、計(jì)算樣品活性

（1）樣品總活性和非特異性活性

比色皿計(jì)算

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 12（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.5 X 10（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升 

轉(zhuǎn)換：?jiǎn)挝?毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾磷/分鐘

96孔板計(jì)算

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 12（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.5 X 0.6 （光徑距離；厘米）X 10（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升 

轉(zhuǎn)換：?jiǎn)挝?毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾磷/分鐘

（2）樣品特異活性

樣品特異活性＝樣品總活性－樣品非特異活性

注意事項(xiàng)

1．本產(chǎn)品為20次（10個(gè)樣本）操作，包括背景對(duì)照

2．操作時(shí)，須戴手套

3．系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次

4．樣品須澄清，至關(guān)重要 

5．比色測(cè)定后，比色皿須清洗*

6．樣本測(cè)定讀數(shù)增高，表明具有酶活性

7．建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/10微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30031.1） 

8．如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

9．磷脂酶C單位活性定義為：在37℃，pH 7.3條件下，每分鐘內(nèi)能夠釋放1微摩爾磷所需的酶量作為一個(gè)活性單位

10．本公司提供系列磷脂酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

使用承諾

本公司秉著“信譽(yù)至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷(xiāo)售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說(shuō)明書(shū)所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題，請(qǐng)立即以書(shū)面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。