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細菌尿素酶活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細菌尿素酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過改良的尿素酶貝特羅反應(yīng)系統(tǒng)中尿素轉(zhuǎn)化為氨分子后峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心改良貝特羅反應(yīng)（Berthelot Reaction）、成功實驗證明的。其適用于各種細菌細胞裂解萃取液樣品尿素酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

許多細菌產(chǎn)生細胞外酶（exoenzyme），稱為水解酶（hydrolase），在水分子的參與下，催化底物的水解，成為細菌生理特征之一。其中尿素酶（Urease），裂解尿素分子為氨分子和二氧化碳，用以識別革藍氏陰性細菌，例如變形桿菌屬（Proteus group）和幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）等。細菌尿素酶在水分子的參與下，催化尿素的水解，產(chǎn)生氨分子，與次氯酸鹽和水楊酸作用后呈現(xiàn)墨綠色和峰值的變化（波長600nm），來定量測定細菌細胞尿素酶的活性。貝特羅反應(yīng)（Berthelot Reaction）系統(tǒng)為：

UREASE

UREA  +  H2O       →      2 NH3  +  CO2

          NITROPRUSSIDE  

NH3  +  CIO-  +  2 salicylate    →      GREEN DYE

NaOH

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A） 15毫升

反應(yīng)液（Reagent B）     1.5毫升

底色液（Reagent C） 15毫升

標準液（Reagent D）     100微升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存反應(yīng)液（Reagent B）在-20℃冰箱里；其余的保存在在4℃冰箱里，避免光照，有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標準樣品操作的容器

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

比色皿：用于反應(yīng)和比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

 實驗步驟

一、測定準備

1．準備好待測樣品（例如細菌裂解萃取液等），置于冰槽里

2．設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長600nm，并置零 

3．準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管

4．分別加入50微升緩沖液（Reagent A）到每個離心管

5．移取50微升標準液（Reagent D）到1號管，混勻

6．小心移取50微升1號管稀釋的標準液（Reagent D）到2號管，混勻

7．小心移取50微升2號管稀釋的標準液（Reagent D）到3號管，混勻

8．小心移取50微升3號管稀釋的標準液（Reagent D）到4號管，混勻

9．將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

管號 緩沖液（Reagent A） 標準液（Reagent D） 測定體系氨分子濃度

1 50微升 50微升 100微摩爾/升

2 50微升 50微升1號管 50微摩爾/升

3 50微升 50微升2號管 25微摩爾/升

4 50微升 50微升3號管 12.5微摩爾/升

5 50微升 0 空白對照管

二、標準曲線測定

1．移取400微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2．加入50微升反應(yīng)液（Reagent B）

3．加入50微升上述配制的標準液

4．加入500微升底色液（Reagent C）

5．上下傾倒數(shù)次，混勻

6．在37℃溫度下孵育5分鐘

7．即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)（A）（注意：實際讀數(shù)＝標準液讀數(shù)－空白對照管讀數(shù)）

8．重復(fù)實驗步驟1至6四次

9．構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位的實際讀數(shù)；橫座標（X軸）為標準氨分子濃度（微摩爾/升）

三、樣品測定

1．移取400微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2．加入50微升反應(yīng)液（Reagent B）

3．加入50微升待測樣品（100微克細菌細胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

4．上下傾倒數(shù)次，混勻

5．在37℃溫度下孵育5分鐘

6．加入500微升底色液（Reagent C）

7．上下傾倒數(shù)次，混勻

8．在37℃溫度下孵育5分鐘

9．即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)（A）（注意：實際讀數(shù)＝樣品讀數(shù)－空白對照管讀數(shù)）

10．根據(jù)標準曲線獲得樣品對應(yīng)氨分子濃度

四、計算樣品活性

[根據(jù)標準曲線獲得樣品對應(yīng)氨分子濃度（微摩爾/升）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[ 0.05（樣品容量；毫升）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）]＝納摩爾氨分子/分鐘/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾氨分子/分鐘/毫克

納摩爾氨分子/分鐘/毫升或納摩爾氨分子/分鐘毫克 X 2 =納摩爾氨分子/分鐘/毫升或毫克

注意事項

1．本產(chǎn)品為25次（比色皿）操作，包括標準液

2．操作時，須戴手套

3．底色液（Reagent C）含有堿性物質(zhì)，注意操作安全

4．一次操作過程中，標準液測定只需1次

5．樣品須澄清，至關(guān)重要（本公司提供細菌可溶性總蛋白制備試劑盒－30022.1）

6．樣品中避免含有氨類和氟化物，否則干擾檢測

7．孵育反應(yīng)完成后即刻進行比色測定；通常3至5分鐘完成反應(yīng)孵育

8．比色測定后，比色皿須清洗*

9．建議待測樣本的蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1） 

10．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

11．酶活性單位濃度定義：在37℃下，pH 7.0的情況下，每單位酶在單位時間內(nèi)（每分鐘）水解1納摩爾尿素為2納摩爾氨分子

12．本公司提供系列細菌生理生化檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感