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革蘭氏陰性細菌外膜囊泡制備試劑盒產(chǎn)品說明書 

主要用途

革蘭氏陰性細菌外膜囊泡制備試劑是一種旨在使用差速離心，分離并收集所有細胞外膜囊泡的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種革蘭氏陰性細菌外膜囊泡及其蛋白的純化。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，萃取產(chǎn)量和純度皆佳。

技術(shù)背景

外膜囊泡（outer membrane vesicle；OMV）為含有周質(zhì)內(nèi)容物（包括外膜蛋白、DNA、RNA、脂多糖、脂質(zhì)、周質(zhì)蛋白、黏附素、免疫調(diào)節(jié)化合物等）的球形電子致密芽狀體（spherical bud），細胞外間隔體，雙層磷脂，20至200納米大小，來自于革蘭氏陰性細菌周邊突起物的釋放形成或胞外分泌產(chǎn)物，使之與環(huán)境或宿主細胞進行反應(yīng)，并調(diào)解各種功能，包括促進病理形成，調(diào)節(jié)細菌互動，轉(zhuǎn)運各種信號分子（例如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素、毒力因子等），保護細菌生存、結(jié)合和侵入，引起毒性，產(chǎn)生抗生素抗性等。外膜囊泡的產(chǎn)量取決于細菌生長周期、營養(yǎng)條件、溫度、氧化應(yīng)激狀態(tài)等。病原菌的外膜囊泡10倍于非病原菌體。外膜囊泡具有疫苗開發(fā)中免疫調(diào)節(jié)潛力。通過差速離心和蛋白酶抑制混合劑，獲得高純外膜囊泡，充分保留其蛋白質(zhì)的免疫和生物學(xué)活性。

產(chǎn)品內(nèi)容

保存液（Reagent A）        毫升

溶解液（Reagent B）        毫升

活性液（Reagent C）        微升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存活性液（Reagent C）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

分光光度儀：用于測定細菌濃度

臺式離心機：用于樣品操作

超速離心機：用于樣品操作

恒溫搖床：用于培養(yǎng)細菌細胞

0.45微米濾膜：用于樣品操作

真空濃縮裝置：用于樣品操作

實驗步驟

實驗開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent C）從－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里凍融，然后移出xx毫升溶解液（Reagent B）到1.5毫升離心管，加入xx微升活性液（Reagent C），充分混勻，置于冰槽里，標記為溶解工作液。然后進行下列操作。

• 準備好1毫升過夜培養(yǎng)的新鮮細菌樣品
• 移取500微升到50毫升細菌培養(yǎng)液（注意：用戶可以進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，例如無鐵培養(yǎng)等）
• 放進37℃恒溫搖床孵育過夜，速度為200RPM
• 在分光光度儀上測OD600為1（1 OD＝1 X 10⁹細胞/毫升；總量為5 X 10¹⁰細胞） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心30分鐘，速度為5000g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管
• 重復(fù)實驗步驟6和7一次
• 使用0.45微米濾膜真空過濾一次
• （選擇步驟）使用100kD蛋白臨界點濃縮處理
• 放進4℃超速離心機離心3小時，速度為150000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升預(yù)冷的保存液（Reagent A）
• 或加入xx微升預(yù)冷的含有 溶解液（Reagent B）和活性液（Reagent C）的溶解工作液
• 用槍頭上下抽吸，充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 即刻放進－70℃冰箱里保存或置于冰冰槽里備用
• 進行后續(xù)蛋白定量、熒光定量或電鏡檢測等

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次（50毫升菌液）操作
• 所有操作須在4℃狀態(tài)下進行
• 建議使用新鮮細菌接種，培養(yǎng)到指數(shù)生長階段為理想狀態(tài)
• 活性液（Reagent C）避免反復(fù)凍融
• 本產(chǎn)品按照50毫升培養(yǎng)菌液配制。如果操作不同菌液容量，可相應(yīng)調(diào)整試劑用量
• 根據(jù)菌種不同，50毫升（OD600＝1）菌液可獲得5至100微克外膜囊泡蛋白
• 制備產(chǎn)物如果放在－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/span>，嚴格避免反復(fù)凍融
• 本公司提供系列細菌試劑產(chǎn)品
    

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無蛋白酶污染