培養(yǎng)基神經(jīng)細(xì)胞分散的實(shí)驗(yàn)過程

   （一）選材。培養(yǎng)基常用胚胎動(dòng)物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認(rèn)為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚，則黑質(zhì)以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細(xì)胞成活率高，顆粒細(xì)胞正在分化；脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng)，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經(jīng)成活率高。

    （二）取材。腦則取出相應(yīng)組織，在解剖液中先剪碎，以使*消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側(cè)，分別培養(yǎng)。

    （三）細(xì)胞培養(yǎng)基分離與接種。神經(jīng)組織用0.125-0.25%*在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去*液，用細(xì)口吸管吹打細(xì)胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，預(yù)置細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)皿（1×106），做電生理應(yīng)為5×105或更低。

    （四）抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長。培養(yǎng)3-5d后，也有人認(rèn)為培養(yǎng)7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長。

    （五）培養(yǎng)基觀察。接種6-12h，開始貼壁，并有集合現(xiàn)象，細(xì)胞生長突起明顯，5-7d膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，7-10d膠質(zhì)細(xì)胞成片于神經(jīng)細(xì)胞下面，形成地毯，2周時(shí)神經(jīng)細(xì)胞生長zui豐滿，四周暈光明顯，一個(gè)月后，有些神經(jīng)細(xì)胞開始退化，變形，甚至出現(xiàn)空泡，一般培養(yǎng)2-4周zui宜。

    但神經(jīng)細(xì)胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會(huì)有細(xì)胞周期，而且隨培養(yǎng)基時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)量在下降，但膠質(zhì)細(xì)胞可以，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也可以。在培養(yǎng)過程中，早期9-12d時(shí)，有較多的神經(jīng)細(xì)胞死亡，培養(yǎng)基這是*次死亡階段，應(yīng)注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細(xì)胞一般突起長而多，且相互形成突觸。