摘要 要在一種宿主表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)外源蛋白并獲得較高產(chǎn)量，必須要較為全面地了解影響其表達(dá)的諸多因素。影響外源基因在巴氏畢赤酵母中表達(dá)的因素主要包括：外源基因的特性、表達(dá)框的染色體整合位點(diǎn)和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因劑量、分泌信號(hào)、產(chǎn)物穩(wěn)定性和翻譯后修飾等。本文就這些因素進(jìn)行分析，并提出一定的對(duì)策和建議。

酵母菌是單細(xì)胞真核生物，具有生長(zhǎng)快、易于遺傳操作、能對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后加工和修飾、不產(chǎn)生有毒產(chǎn)物等特點(diǎn)，被認(rèn)為是表達(dá)外源蛋白的合適宿主。幾種工業(yè)酵母尤其是巴氏畢赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生長(zhǎng)力以及其它一些*的性質(zhì)，已發(fā)展成為較成熟的蛋白生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)。已有許多細(xì)菌、真菌和高等動(dòng)植物的基因在Pp中成功表達(dá)(如破傷風(fēng)毒素片段Ｃ，12g/L)，但也有許多蛋白的表達(dá)量并不理想(如多瘤病毒大T抗原，0.5mg/L)，甚至不能表達(dá)(如HIV表面糖蛋白)。另外，酵母表達(dá)系統(tǒng)的局限性還在于分泌產(chǎn)物的不均一性，包括聚合體的存在、信號(hào)肽加工不*以及內(nèi)部降解等現(xiàn)象。所有這些都提醒我們?cè)赑p中表達(dá)外源蛋白時(shí)，應(yīng)周密考慮影響其表達(dá)的各個(gè)因素。

1、外源基因特性 
外源基因在Pp中表達(dá)時(shí)，其自身就是影響表達(dá)水平的重要因素。不同的培養(yǎng)基配方、發(fā)酵參數(shù)和飼養(yǎng)方案主要是通過(guò)提高細(xì)胞總數(shù)而并非單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)率來(lái)提高外源蛋白的產(chǎn)量。Fahnestock等發(fā)現(xiàn)隨著外源的蛛牽拉絲蛋白基因拷貝數(shù)的增加，其生產(chǎn)效率會(huì)相對(duì)有所降低。另外，許多高A+T含量的基因常會(huì)由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄引;不合適的mRNA5'非翻譯區(qū)的核苛酸序列和長(zhǎng)度也可能會(huì)便基因的表達(dá)不盡如人意。提前終止被認(rèn)為是一種具有種屬特異性的現(xiàn)象，譬如在Pp中不能表達(dá)的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中卻表達(dá)良好。因此，可以通過(guò)調(diào)整高A+T含量區(qū)的核甘酸組成來(lái)避免提前終止的發(fā)生。而Sreekrishna等通過(guò)調(diào)整人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5'非翻譯區(qū)與醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5'非翻譯區(qū)相同后，HSA的表達(dá)量可以提高50倍以上。但遺憾的是，限于目前對(duì)Pp的了解程度，仍然無(wú)法預(yù)見(jiàn)某種外源蛋白是否能在其中獲得高產(chǎn)甚至僅僅能否表達(dá)。至僅僅能否表達(dá)。 

2、表達(dá)框的染色體整合位點(diǎn)和方式 
雖然相對(duì)于自主復(fù)制載體來(lái)講，整合性載體的轉(zhuǎn)化率較低，但由于Pp沒(méi)有天然質(zhì)粒，所以設(shè)計(jì)表達(dá)載體偏向于染色體整合，通過(guò)同源重組，載體整合到細(xì)胞染色體中間。整合性載體具有表達(dá)框穩(wěn)定和可控制整合位點(diǎn)等*性，并且能夠發(fā)生多位點(diǎn)整合而獲得多拷貝。 
AOXl和組氨酸脫氫酶(histidinol dehydrogenase , HIS4)基因位點(diǎn)都已被成功用于表達(dá)外源蛋白。Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表達(dá)框偶有缺失。這種缺失源于表達(dá)框中his4染色體突變拷貝與完好的his4基因的基因轉(zhuǎn)換。因此，看起來(lái)aox1位點(diǎn)是較為理想的位點(diǎn)。 

3、宿主菌的甲醇利用表型(Mut＋和 MutＳ) 
用末端與aox1基因5'和3'端同源的線性DNA轉(zhuǎn)化Pp HIS4菌株可導(dǎo)致Mx1結(jié)構(gòu)基因的特異性剔除。aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢(methanol utilization slow , MutＳ或Mut-)，它們只能利用弱的aox2基因啟動(dòng)合成aox2基因啟動(dòng)合成AOX；而aox1基因完整的酵母則生長(zhǎng)正常(Mut＋)。原則上，如果是胞內(nèi)表達(dá)，應(yīng)盡量用Mut－細(xì)胞，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對(duì)較多(約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進(jìn)行。當(dāng)誘導(dǎo)AOX1時(shí)，轉(zhuǎn)化子不能同時(shí)高水平產(chǎn)生酒精氧化酶和外源蛋白，與野生型Mut＋比較，Mut－細(xì)胞對(duì)氧的要求亦較低，生長(zhǎng)也較慢。為解決這個(gè)問(wèn)題，Jeffrey等用甲醇加甘油混合飼養(yǎng)，得到了255mg/L的CD40配體(CD40L)。但由于甘油可部分阻遏aoxl啟動(dòng)子，蛋白表達(dá)可能并不處于佳水平。Sreekrishna等zui近運(yùn)用山梨醇和甲醇混合批量飼養(yǎng)發(fā)酵，在不到4個(gè)星期的時(shí)間里，他們用一個(gè)4L的發(fā)酵罐連續(xù)完成了幾個(gè)周期的生產(chǎn)。在這種發(fā)酵方式中，大部分碳源由山梨醇提供，減少了總的甲醇消耗，因而效率大大提高。 
zui近，一種無(wú)需甲醇誘導(dǎo)而能組成性表達(dá)外源蛋白的畢赤酵母載體pCAPZ和pGAPZa已經(jīng)構(gòu)建成功，組成性表達(dá)的蛋白量與該蛋白對(duì)酵母菌的毒性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)它們常能生產(chǎn)比誘導(dǎo)型載體pPICZ和pPICZa更高的外源蛋白。這些載體均利用了編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因的啟動(dòng)子。 Doring等分別用pGAPZB和pPICZB來(lái)生產(chǎn)兔腎肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（rPEPT2）以及人小腸肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(hPEPT2),結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者表達(dá)的此兩種蛋白的產(chǎn)量均比后者高4倍?？磥?lái)在生產(chǎn)哺乳動(dòng)物膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白時(shí)，pGAP比pAOX1更理想。

4、基因劑量 
許多實(shí)例表明，含單拷貝表達(dá)框的宿主菌足以得到佳產(chǎn)量，而在大多數(shù)情況下，隨著拷貝數(shù)的增加表達(dá)產(chǎn)物量也會(huì)相應(yīng)增加。 Jeffrey等發(fā)現(xiàn)，重組CD40L的zui高產(chǎn)量是在含有8個(gè)以上表達(dá)框的菌株中獲得的。Clare等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，重組鼠表皮生長(zhǎng)因子(mECF) 在Pp中的表達(dá)量與其基因量成正相關(guān)，而高拷貝、高表達(dá)量的宿主菌株可以通過(guò)一種快速DNA斑點(diǎn)雜交的篩選方式獲得。不過(guò)個(gè)別情況下拷貝數(shù)增加對(duì)產(chǎn)量也會(huì)產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)，似乎表明分泌效率低的蛋白在過(guò)高表達(dá)的情況下會(huì)對(duì)分泌途徑形成負(fù)反饋抑制。 
因此，基因拷貝數(shù)對(duì)表達(dá)量的影響是無(wú)法預(yù)測(cè)的。高表達(dá)菌株的篩選只應(yīng)以表達(dá)的蛋白量為*標(biāo)準(zhǔn)。Jeffrey等建立了一種雙濾膜篩查方法，首先將菌落轉(zhuǎn)在醋酸纖維素膜上，再與硝酸纖維素膜疊放在酵母固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，分泌蛋白就印在硝酸纖維素膜上。再用此蛋白的抗體檢測(cè)，即可挑出zui高蛋白量對(duì)應(yīng)的克隆。用這種方法，每套濾膜可篩選 100-1000個(gè)克隆，從而快速地從大量重組菌株中篩選出高表達(dá)克隆，并從每升發(fā)酵上清液中獲得了255mg的重組cD40L。

5、分泌信號(hào) 
對(duì)于一個(gè)原本就不能分泌的蛋白來(lái)說(shuō)，采用分泌方式生產(chǎn)是非常困難甚至是不可能的。但為了下游工程處理的方便，外源蛋白的生產(chǎn)應(yīng)盡量考慮采用分泌表達(dá)的方式。有些情況下外源蛋白自身的信號(hào)肽就足夠了。如果不能利用自身信號(hào)肽，那么釀酒酵母轉(zhuǎn)換酶或a配對(duì)因子(AMF)的前導(dǎo)序列可以非常有效地引導(dǎo)體積稍小的產(chǎn)物出胞。一般情況下，應(yīng)用酵母*的分泌信號(hào)表達(dá)外源基因獲得成功的可能性大。 
但酵母表達(dá)基因工程產(chǎn)物的另一問(wèn)題是信號(hào)肽加工不*，其表達(dá)的外源基因產(chǎn)物常比設(shè)計(jì)的多幾個(gè)氨基酸。這可能是酵母細(xì)胞自身調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)外源基因高表達(dá)的應(yīng)答表現(xiàn)。Singh等通過(guò)定向缺失誘變MFa1和干擾素基因連接處寡核甘酸導(dǎo)致了含有天然N端的成熟干擾素的正確釋放，可以成為解決這一問(wèn)題的一種好方法。 

6、產(chǎn)物穩(wěn)定性 
酵母細(xì)胞膜上有一種KEX-2樣蛋白水解酶，能專一性水解a因子前體中羧基端的肽鍵，即連續(xù)兩個(gè)堿性氨基酸(如LySArg，LysLys，ArgArg，LsArg)，酵母基因工程表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生降解現(xiàn)象的原因就在于此。改變培養(yǎng)基的PH值、加入適量的酵母提取物和蛋白胨或酪蛋白水解物，都能夠提高外源蛋白的穩(wěn)定性，而某些酶抑制劑如EDTA，雖然也能增加其穩(wěn)定性，但卻常會(huì)使一些原先并不明顯的蛋白變得非常明顯，影響其使用效果。 
另外，使用蛋白酶缺陷株如SMD1163、 SMD1165或SMD1168亦可避免產(chǎn)物降解的發(fā)生。雖然并不是每一種外源蛋白都會(huì)受內(nèi)源性蛋白酶的影響，但在未知其有無(wú)降解可能的情況下可以考慮使用此種宿主菌。 
在另外一種情況下，如果基因工程產(chǎn)物會(huì)影響宿主菌生長(zhǎng)代謝活性的話，也可能出現(xiàn)高度降解的情況。如重組人基質(zhì)金屬蛋白酶 3(MMP-3)被認(rèn)為有促使哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞凋亡的作用。它在Pp中高度降解，僅當(dāng)與其組織抑制物TIMP-1共表達(dá)時(shí)才能保持穩(wěn)定。這也提醒我們外源基因本身對(duì)產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響同樣重要。

7、翻譯后修飾 
一般情況下Pp能產(chǎn)生較釀酒酵母明顯要短的高甘露糖型寡糖鏈，且較均一，長(zhǎng)度在8－14個(gè)之間，使產(chǎn)物更加穩(wěn)定，而這正是Pp表達(dá)外源蛋白的一個(gè)優(yōu)勢(shì)。雖然糖基化對(duì)某些外源蛋白的活性沒(méi)有太大影響，它卻可能在蛋白折疊和抗蛋白酶降解中起重要作用。然而，糖基化也有其不利的一面。例如人紅細(xì)胞生成素受體的胞外配體結(jié)合區(qū)(EPObp)因糖基化程度不同而呈兩種狀態(tài)(30X103和60X103);人組織因子則在SDS-PAGE上以從37X103到45X103的3個(gè)條帶存在。另外，聚合體的存在也會(huì)成為產(chǎn)物不均一的原因，這些都給基因工程產(chǎn)物的純化和工業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)一定困難。從藥物應(yīng)用的觀點(diǎn)來(lái)看，不合適的糖基化和寡聚體可能會(huì)在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)或毒副作用，并且會(huì)明顯影響純化過(guò)程中產(chǎn)率的提高，因此，選用一種能夠獲得單體均一形式的基因工程產(chǎn)物十分重要。這方面的研究仍有待探索。 
作為一種正在發(fā)展中的表達(dá)異源蛋白的宿主體，Pp酵母菌兼有原核細(xì)胞的分子遺傳操作和生長(zhǎng)特性及真核生物的翻譯后修飾機(jī)制的長(zhǎng)處。雖然目前存在的諸多困難使得仍有許多蛋白難以在這個(gè)系統(tǒng)中成功表達(dá)，但隨著對(duì)它的利用和探索的不斷深入必將不斷給我們?cè)鎏硇碌囊?jiàn)解，使我們有理由相信會(huì)zui終解決這些困難，將巴氏畢赤酵母系統(tǒng)不斷完善。