一確保樣品均質(zhì)化
維持原始樣品的保真度開始于收集的那一刻。*步就是確保擁有均質(zhì)性的樣品。比利時(shí)根特大學(xué)微生物學(xué)家Kim Heylen說，“如果樣品沒有均質(zhì)化，那就讓它均質(zhì)化。如果想要擁有可以復(fù)制的二次抽樣樣品（subsample），[這樣做]是至關(guān)重要的。”
美國加州大學(xué)戴維斯分校微生物學(xué)家、博士后研究員Holly Ganz在一家非盈利機(jī)構(gòu)KittyBiome開始職業(yè)生涯，其中該非盈利機(jī)構(gòu)研究野貓和家貓的微生物組，研究對象通常為它們的糞便樣品。Ganz說，“糞便并不是均質(zhì)性的。它存在一個(gè)問題：以糞便中哪一部分為樣品將影響研究結(jié)果。” Ganz首先移除糞便的外層，這是因?yàn)橥鈱涌赡芎协h(huán)境污染物，接著將糞便剩余部分放入塑料袋中以便一起磨碎和混合。接下來，她將樣品沿著薄板鋪展開來，并且從中二次抽樣樣品。她說，“讓糞便均質(zhì)化是非常困難的，因此我是增加我獲取二次抽樣樣品的次數(shù)。”

在zui近對人腸道微生物組的研究中，研究人員利用研缽及研杵搗碎加有液氮的糞便樣品，然后將形成的粉末分配成較少的樣品，轉(zhuǎn)移到試管中，然后在−80 °C下凍存。相比于來自未均質(zhì)化的新鮮樣品的二次抽樣樣品，利用這種方法制備的樣品在微生物組成上表現(xiàn)出減少的變化（參照文獻(xiàn)3）。

土壤具有更加復(fù)雜的基質(zhì)。Gilbert建議將土壤樣品放入攪拌機(jī)中盡可能地?cái)囁轭w粒物。他說，“*均質(zhì)化是不可能的。”研究人員也建議在初次收集樣品后，進(jìn)行多次重復(fù)地等分，這是因?yàn)槎啻蝺鋈谘h(huán)破壞核酸質(zhì)量。比如，科學(xué)家們使用無菌的一次性活檢鉗（biopsy punch）從一個(gè)更大的原始樣品中收集幾乎相同大小的凍存糞便顆粒。然后，直接將這些顆粒放入含有核酸裂解液中的提取管中。這種方法僅僅通過對原始的樣品進(jìn)行等分，為科學(xué)家們節(jié)省整整一次凍融循環(huán)。
二應(yīng)當(dāng)使用一種低溫保存劑？如果應(yīng)當(dāng)，那么使用哪種？
低溫保存劑（cryopreservant）---在給定樣品中讓核酸保持穩(wěn)定的緩沖液---提供低技術(shù)的冷藏液。低溫凍存讓細(xì)胞免受凍結(jié)溫度下的冰塊形成和溫度波動(dòng)導(dǎo)致的機(jī)械損傷。
使用哪種低溫保存劑主要依賴于計(jì)劃如何使用樣品。如果想要培養(yǎng)細(xì)菌或者需要讓它們活著，那么可能使用甘油，它阻止冰晶在低至−20 °C～−80 °C的溫度下形成。位于美國馬薩諸塞州梅德福市的非盈利性糞便庫OpenBiome收集來自健康人的糞便樣品來治療感染上艱難梭菌（Clostridium difficile）的病人。OpenBiome質(zhì)量Daniel Blackler說，鑒于糞便移植治療的成功依賴于擁有活的細(xì)菌，因此將糞便樣品與含有12.5%甘油的鹽溶液混合，然后在−20 °C下可儲存長達(dá)6個(gè)月，在−80 °C下可儲存長達(dá)2年。
如果研究人員只是計(jì)劃研究核酸組成，那么他們有更多選擇。對這種類型的研究而言，在儲存之前，將樣品加入到一種裂解液中。盡管很少有研究比較了不同低溫保存劑在維持原始樣品多樣性上的影響，但是已有證據(jù)提示著低溫保存劑能夠在不同程度上影響不同微生物物種的存在（參照文獻(xiàn)4）。Hale建議道，“關(guān)鍵在于針對自己的研究，選擇一種可行的和合適的方法，同時(shí)也意識到它的潛在差錯(cuò)。”
總體而言，研究人員發(fā)現(xiàn)加入一種低溫保存劑有益于人類樣品。Ganz注意到，在比較儲存的樣品和新鮮樣品的微生物組成之前，一種快速地評價(jià)低溫保存取得成功的方法是看一下DNA產(chǎn)量。她說，“如果不能獲得足夠的DNA，那么就不能足夠好地代表[樣品中的]微生物組。”
2.1 二甲基亞砜+海藻糖+胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基
Heylen使用二甲基亞砜（DMSO）溶液、海藻糖和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（Tryptic Soy Broth， TSB），從而有助維持三種微生物組系統(tǒng)中冷凍樣品的保真度（參照文獻(xiàn)5）。Heylen說，“海藻糖阻止細(xì)胞干燥，而TSB也是一種低溫保存劑。”她建議先將這種溶液放置在大約4 °C下，然后將它加入到即將放入一種超低溫度冷藏箱內(nèi)的樣品中。“如果沒有−80 °C冷藏箱的話，那么也能夠使用家用冷藏箱。但是肯定要盡可能快地凍存樣品，而且在沒有一種低溫保存劑的存在下不要凍存。”
2.2 保存劑RNAlater
起初開發(fā)出來是作為一種RNA保存劑使用的，RNAlater是一種無毒的水溶液，由諸如Qiagen公司（50mL的78美元，250mL的324美元）和Thermo Fisher公司（100mL的125美元；500mL的386美元）之類的制造商銷售，也能夠被用來保存DNA。在與人類微生物組項(xiàng)目（Human Microbiome Project）合作時(shí)，哈佛大學(xué)陳曾熙公共衛(wèi)生學(xué)院（Harvard T.H.Chan School of Public Health）計(jì)算生物學(xué)家Curtis Huttenhower和他的同事們發(fā)現(xiàn)在樣品收集后，如果沒有冷藏箱可供使用的話，那么加入這種保存劑也能夠起作用。
但是RNAlater也具有一些用戶報(bào)道的缺陷。盡管它沒有可燃性的事實(shí)使得這種保存劑成為一種用于樣品運(yùn)輸?shù)暮线m選擇，但是相比于新鮮提取的樣品，它顯著地降低擬桿菌門（Bacteroidetes）細(xì)菌和瘤胃菌科（Ruminococcaceae）細(xì)菌群體。Ganz建議道，“RNAlater阻止樣品正常地形成顆粒沉淀，因此在移除RNAlater之后，不得不再次利用磷酸鹽緩沖液清洗這種沉淀。”
根據(jù)美國伍茲霍爾海洋研究所海洋生物化學(xué)家Mak Saito的說法，RNAlater的另一個(gè)潛在問題是它的高鹽含量，這對一些醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)程序而言，進(jìn)行樣品處理也令人頭疼。Saito利用這種溶液協(xié)助保存海洋微生物組中的蛋白組成（參照文獻(xiàn)6）。
2.3 乙醇
相對于RNAlater而言，乙醇是一種更加便宜的替代性選擇，而且已證實(shí)它在八周多的時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定地保存糞便樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)，即便是在室溫下，也是如此（參照文獻(xiàn)4）。然而，乙醇是可燃的，因此它不能用于樣品運(yùn)輸之中。更重要的是，相對于新鮮收集并進(jìn)行分析的樣品，利用乙醇進(jìn)行的低溫保存導(dǎo)致藍(lán)藻細(xì)菌（Cyanobacteria）數(shù)量增加。Ganz說，“所有這些儲存方法都會(huì)帶來偏差，因此研究中總是使用同一種方法是較為重要的。” Ganz是在接受儲存蜘蛛猴糞便的同事們的建議之后，將她收集的貓糞便樣品保存在70%乙醇中。
2.4 不使用低溫保存劑
對一些類型的樣品而言，加入一種低溫保存劑會(huì)改變微生物組成太多而不值得。Gilbert說，土壤就是這種情形。他建議在−80 °C下凍存土壤樣品48小時(shí)。他說，“我們想要在收集這種樣品時(shí)就看看它的微生物群落組成和結(jié)構(gòu)。”在土壤樣品非常潮濕的環(huán)境中，Gilbert立即凍存它們，這是因?yàn)楦咚趾磕軌驅(qū)е履承╊愋偷募?xì)菌增殖。
對糞便樣品而言，有時(shí)低溫凍存也并不合適。Blackler說，比如，用于治療艱難梭菌感染的糞便樣品能夠在室溫下保存長達(dá)6個(gè)小時(shí)，同時(shí)不會(huì)導(dǎo)致治療質(zhì)量發(fā)生顯著變化。
三其他的溫度考慮因素
微生物組樣品對凍融循環(huán)非常敏感。Hale說，“解凍能夠?qū)е挛⑸锝M樣品產(chǎn)生嚴(yán)重偏差。在每個(gè)凍融循環(huán)期間，DNA都會(huì)降解，而且當(dāng)樣品解凍時(shí)，污染和微生物大量生長的情形也能夠發(fā)生，此外，揮發(fā)性化合物丟失并且不能回收用于潛在的代謝組學(xué)分析。”
如果只有−20 °C冷藏箱可供使用，那么這種冷藏箱只用于儲存微生物組樣品。Heylen說，“如果−20 °C冷藏箱持續(xù)打開，那么溫度能夠發(fā)生變化，這會(huì)使得儲存成功率顯著下降。”
在OpenBiome，研究人員在將樣品轉(zhuǎn)移到−80 °C下儲存更長時(shí)間之前，讓它們在−20 °C下持續(xù)凍存長達(dá)6個(gè)月。Blackler說，將樣品轉(zhuǎn)移到超低溫冷藏箱中應(yīng)當(dāng)不會(huì)對微生物產(chǎn)生負(fù)面影響。然而，“溫度突然上升應(yīng)當(dāng)盡可能地避免，因?yàn)檫@會(huì)影響微生物群落。”

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