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脂蛋白脂酶(LPL)﹠肝脂酶(HL)活性測定試劑盒

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測定意義:

LPLlipoprotein lipase)存在于肝外組織毛細血管內(nèi)皮細胞表面,催化血漿中乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白(VLDL)中甘油三酯(TG)的水解,在CMVLDL的降解中發(fā)揮重要作用。HLhepatic lipase)僅存在于肝內(nèi)皮細胞表面,在中密度脂蛋白(IDL)和高密度脂蛋白(HDL)代謝中起重要作用。LPL HL活性降低,可引起高甘油三酯血癥。在高脂血癥、動脈粥樣硬化的發(fā)病機理及脂蛋白代謝研究中,常常需要測定LPLHL活性。

測定原理:

LPLHL均能水解乳劑中TG,生成游離脂肪酸;進一步通過銅試劑法測定體系中游離脂肪酸的生成。

自備儀器和用品:

研缽、冰、臺式離心機、微量注射器、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、肝素鈉、氯坊(三氯鉀烷)、無水乙醇和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,4保存。

試劑二:液體×1瓶,室溫保存。

試劑三:自備。實驗前1 d,在10 mL試劑瓶中加入4.8 mL正庚烷,0.2 mL無水鉀醇,5 mL氯坊(自備),蓋緊后混勻,室溫保存。

試劑四:液體×1瓶,室溫保存。

試劑五:粉劑×1瓶,4保存。臨用前向試劑瓶中加入5 mL無水乙醇,充分溶解。

標準品:粉劑×1瓶,室溫保存。臨用前向試劑瓶中加入7.8 mL氯坊充分溶解,即為500μmol/L的棕櫚酸標準溶液。

粗酶液提?。?/span>

1血液中LPLHL活性測定:按動物體重,150U/kg肝素鈉溶液靜脈注射,20min后取血液,即下表中粗酶液,待測。

2、組織中LPLHL活性測定:組織用生理鹽水沖洗干凈后,用吸水紙吸取表面水分,稱取約0.1 g樣品,加入1 mL生理鹽水,冰浴勻漿,8000rpm4離心10min,取上清液,即粗酶液,待測。

LPLHL測定操作:

1. 分光光度計預熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長到550 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管:取帶蓋 玻璃試管,加入2 μL蒸餾水,100μL試劑三,40 μL試劑四,40μL試劑五,蓋緊后充分震蕩混勻(2min),倒入微量石英比色皿/96孔板,靜置15min,于550nm光吸收,記為A空白管。

3. 標準管:取帶蓋 玻璃試管,加入2 μL標準液,100μL試劑三,40 μL試劑四,40μL試劑五,蓋緊后充分震蕩混勻(2min),倒入微量石英比色皿/96孔板,靜置15min,于550nm光吸收,記為A標準管。

4. 總脂酶測定管:取帶蓋玻璃試管,加入10 μL粗酶液,100μL蒸餾水,100μL試劑二,蓋緊后混勻;37水浴準確保溫60min;吸取2μL上述溶液,加入另一個0.5mL EP管,加入100μL試劑三,40 μL試劑四,40μL試劑五,蓋緊后充分震蕩混勻(2min),倒入微量石英比色皿/96孔板,靜置15min,于550nm光吸收,記為A總脂酶管。

5. 肝脂酶測定管:取帶蓋玻璃試管,加入10 μL粗酶液,100μL試劑一,100μL試劑二,蓋緊后混勻;37水浴準確保溫60min;吸取2μL上述溶液,加入另一個0.5mL EP管,加入100μL試劑三,40 μL試劑四,40μL試劑五,蓋緊后充分震蕩混勻(2min),倒入微量石英比色皿/96孔板,靜置15min,于550nm光吸收,記為A肝脂酶管。

LPLHL活性計算:

 a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1.血液中LPLHL活性計算

活性單位定義:37中每毫升血清(漿)每分鐘在反應系統(tǒng)中所產(chǎn)生的 1 μ mol FFA。

總脂酶活性(U/mL=[ C標準液÷(A總脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V反總÷(V÷V樣總)÷T

=0.7×(A總脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)

肝脂酶(HL)活性(U/mL=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)

脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL=總脂酶活性-HL

C標準液:標準品濃度,500 μmol/L=0.5 μmol/mL;V反總:催化反應體系總體積,10+100+100=210μL=0.21 mL;V樣:加入催化反應體系中粗酶液體積,10μL;V樣總:粗酶液總體積,1mL=1000μL;T:催化反應時間,15 min。

2. 組織中LPLHL活性計算

1)按蛋白濃度計算

37中每毫克蛋白每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol FFA。

總脂酶活性(U/mg pr

=[ C標準液÷(A總脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V反總÷(Cpr×V)÷T

=0.7×(A總脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷Cpr

肝脂酶(HL)活性(U/mL

=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷Cpr

脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL=總脂酶活性-HL

2按樣本鮮重計算

37中每克樣品每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol FFA。

總脂酶活性(U/g 鮮重)

=[ C標準液÷(A總脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V反總÷(V÷V樣總×W)÷T

=0.7×(A總脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷W

肝脂酶(HL)活性(U/mL=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷W

脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL=總脂酶活性-HL

C標準液:標準品濃度,500 μmol/L=0.5 μmol/mL;V反總:催化反應體系總體積,10+100+100=210μL=0.21 mLV樣:加入催化反應體系中粗酶液體積,50μL=0.05 mLV樣總:提取液體積,1 mLCpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度,mg/mLT:催化反應時間,15 min

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1.血液中LPLHL活性計算

活性單位定義:37中每毫升血清(漿)每分鐘在反應系統(tǒng)中所產(chǎn)生的 1 μmol FFA。

總脂酶活性(U/mL=[ C標準液÷(A總脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V反總÷(V÷V樣總)÷T

=0.7×(A總脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)

肝脂酶(HL)活性(U/mL=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)

脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL=總脂酶活性-HL

C標準液:標準品濃度,500 μmol/L=0.5 μmol/mLV反總:催化反應體系總體積,10+100+100=210μL=0.21 mL;V樣:加入催化反應體系中粗酶液體積,10μLV樣總:粗酶液總體積,1mL=1000μLT:催化反應時間,15 min。

2. 組織中LPLHL活性計算

1)按蛋白濃度計算

37中每毫克蛋白每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol FFA

總脂酶活性(U/mg pr

=[ C標準液÷(A總脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V反總÷(Cpr×V)÷T

=0.7×(A總脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷Cpr

肝脂酶(HL)活性(U/mL

=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷Cpr

脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL=總脂酶活性-HL

2按樣本鮮重計算

37中每克樣品每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol FFA。

總脂酶活性(U/g 鮮重)

=[ C標準液÷(A總脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V反總÷(V÷V樣總×W)÷T

=0.7×(A總脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷W

肝脂酶(HL)活性(U/mL=0.7×(A肝脂酶管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷W

脂蛋白脂酶(LPL)活性(U/mL=總脂酶活性-HL

C標準液:標準品濃度,500 μmol/L=0.5 μmol/mLV反總:催化反應體系總體積,10+100+100=210μL=0.21 mL;V樣:加入催化反應體系中粗酶液體積,50μL=0.05 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;T:催化反應時間,15 min。

 

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