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中級會(huì)員 | 第11年

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丙酮酸脫羧酶(PDC)活性測定試劑盒

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測定意義:

PDC主要存在于酵母中,是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶之一,催化丙酮酸脫羧生成乙醛。

測定原理:

PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛,添加乙醇脫氫酶(ADH)來進(jìn)一步催化 NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+NADH340 nm有吸收峰,而NAD+沒有;通過測定340 nm光吸收下降速率,來計(jì)算PDC活性。

自備儀器和用品:

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,4保存。

試劑二:液體×1瓶,4保存。

試劑三:液體×1瓶,4保存。

試劑四:液體×1瓶,﹣20保存。

混合試劑:臨用前配制,小心把試劑四轉(zhuǎn)移到試劑三中,充分溶解。

試劑六:液體×1管,4保存。

粗酶液提?。?/span>

稱取約0.1g樣品,加試劑一1 mL,冰上充分研磨,16000g 4離心20min,取上清液,待測。

PDC測定操作:

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長到340 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于25水浴中預(yù)熱30min以上。

3. 空白管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸餾水、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六,迅速混勻后于340nm比色,記錄15s75s的吸光值,分別記為A1A2。

4. 測定管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六,迅速混勻后于340nm比色,記錄15s75s的吸光值,分別記為A3A4。

PDC活性計(jì)算:

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1)按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25中,每毫克蛋白每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1U。

PDC (U/mg prot) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷(ε×d)×V×106}÷(Cpr×V) ÷T

=1.61×[(A3A4)(A1-A2)]÷Cpr

2按樣本鮮重計(jì)算

活性單位定義:25中,每克樣品每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1U。

PDC (U/g 鮮重) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷(ε×d)×V×106(V÷V樣總×W) ÷T

=1.61×[(A3A4)(A1-A2)]÷W

εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL=2×10-4 L,V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,0.02mL;V樣總:提取液體積,1 mL;Cpr:蛋白濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒;W 樣品質(zhì)量; T:反應(yīng)時(shí)間,1 min。

b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下

1)按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25中,每毫克蛋白每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1U。

PDC (U/mg prot) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷(ε×d)×V×106}÷(Cpr×V) ÷T

=3.22×[(A3A4)(A1-A2)]÷Cpr

2按樣本鮮重計(jì)算

活性單位定義:25中,每克樣品每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1U。

PDC (U/g 鮮重) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷(ε×d)×V×106(V÷V樣總×W) ÷T

=3.22×[(A3A4)(A1-A2)]÷W

εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d96孔板光徑,0.5 cm;V總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL=2×10-4 LV樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,0.02mL;V樣總:提取液體積,1 mL;Cpr:蛋白濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒;W 樣品質(zhì)量; T:反應(yīng)時(shí)間,1 min。

 

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