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技術(shù)文章

丙酮酸(pyruvic acid PA)含量測(cè)定試劑盒說明書

閱讀:581發(fā)布時(shí)間:2015-6-27

測(cè)定意義:
丙酮酸通過乙酰CoA 連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝,起著重要的樞紐作用。
測(cè)定原理:
丙酮酸與2,4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙,在堿性溶液中呈櫻紅色。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:液體50mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:液體5mL×1 瓶, 4℃保存;
試劑二:液體25mL×1 瓶, 4℃保存。
丙酮酸提?。?BR>1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量
(104 個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1 的比例(建議500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 提
取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30 次),靜置30min,
8000g,常溫離心10min,取上清待測(cè)。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10 的比例(建議稱取約0.1g 組織,
加入1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,靜置30min,8000g,常溫離心10min,取上清待測(cè)。
3、血清(漿)樣品:按照血清(漿)體積(mL):提取液體積(mL)為1:5~10 的比例(建
議取0.1mL 血清(漿)加入1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,靜置30min, 8000g,常溫離心
10min,取上清待測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至520nm,蒸餾水調(diào)零。
2、取300μL 樣本+100μL 試劑一于1.5mL EP 管中,混勻,靜置2min,加入500μL 試劑二,
混勻,于520nm 波長(zhǎng)處測(cè)定管吸光值A(chǔ)。
丙酮酸含量計(jì)算:
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0466x + 0.0675; x 為丙酮酸鈉含量(μg/mL),y 為吸
光值。
2、按照血清(漿)體積計(jì)算
丙酮酸含量(μg/mL)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V3×V1÷V2)=214.6×(A-0.0675)
3、按照蛋白濃度計(jì)算
丙酮酸含量(μg/mg prot)=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr
4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算
丙酮酸含量(μg/g 鮮重)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2)=21.46×(A-0.0675) ÷W
3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
丙酮酸含量(μg/104 cell)=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(500×V1÷V2)=0.043×(A-0.0675)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.3mL;V2:加入提取液體積,1 mL;V3:加入血清(漿)
體積,0.1 mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),
500 萬。


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