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上海通蔚生物科技有限公司

免疫熒光的直接法和間接法

時(shí)間:2015-7-7閱讀:313
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免疫熒光法

1.直接法

(1)冰凍切片、涂片、印片或單層 細(xì)胞培養(yǎng) 物按要求進(jìn)行固定,石蠟切片常規(guī)脫蠟后用酶消化處理,然后水化,用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分鐘,冷風(fēng)吹干,放入濕盒中。

(2)滴加經(jīng)稀釋的熒光抗體,37℃ 30-60分鐘或4℃ 過夜(3)PBS 洗2次,蒸餾水洗1次

(4)50%甘油緩沖液封片

(5)熒光顯微鏡下檢查

(6)對(duì)照染色

①陽性對(duì)照,用已經(jīng)證實(shí)的含有靶抗原的組織切片與待檢標(biāo)本同樣處理,結(jié)果應(yīng)為陽性。②陰性對(duì)照,用確知不存在靶抗原的組織切片與待檢標(biāo)本同樣處理,結(jié)果應(yīng)為陰性。③空白對(duì)照,用免去特異性抗體或用PBS替代特異性抗體,結(jié)果應(yīng)為陰性。④抑制試驗(yàn),將標(biāo)記抗體(例熒光抗體)和未標(biāo)記的抗體或血清等量混合后,按上述步驟處理切片,結(jié)果應(yīng)為陰性(一步法)?;?qū)⒋龣z切片兩張,一張加未標(biāo)記特異性血清,另一張加未標(biāo)記同種正常血清,孵育后沖洗,再加入標(biāo)記的特異性血清(例如特異性熒光標(biāo)記抗體),加了未標(biāo)記特異性血清的切片因抗原抗休已結(jié)合,故染色被抑制,呈陰性結(jié)果,而加同種正常血清的切片則呈陽性反應(yīng)(二步法)。

對(duì)照染色非常重要,開始試驗(yàn)時(shí)應(yīng)做全面對(duì)照,每次試驗(yàn)時(shí)應(yīng)做陽性和陰性對(duì)照。

2.間接法

(1)標(biāo)本處理同直接法。

(2)滴加適當(dāng)稀釋的特異性抗體于標(biāo)本上,置濕盒中,37℃ 30~60分鐘或4℃過夜。

(3)滴加適當(dāng)稀釋的間接熒光抗體,置濕盒中,37℃ 30~60分鐘。

(5)PBS洗2次,雙蒸水洗1次。

(6)甘油緩沖液封片,熒光顯微鏡下觀察。

(7)對(duì)照染色:可用空白對(duì)照和陰性對(duì)照等。

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