免疫熒光法

１．直接法

（1）冰凍切片、涂片、印片或單層 細(xì)胞培養(yǎng) 物按要求進(jìn)行固定，石蠟切片常規(guī)脫蠟后用酶消化處理，然后水化，用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分鐘，冷風(fēng)吹干，放入濕盒中。

（2）滴加經(jīng)稀釋的熒光抗體，37℃ 30-60分鐘或4℃ 過夜（3）PBS 洗2次，蒸餾水洗1次

（4）50%甘油緩沖液封片

（5）熒光顯微鏡下檢查

（6）對(duì)照染色

①陽性對(duì)照，用已經(jīng)證實(shí)的含有靶抗原的組織切片與待檢標(biāo)本同樣處理，結(jié)果應(yīng)為陽性。②陰性對(duì)照，用確知不存在靶抗原的組織切片與待檢標(biāo)本同樣處理，結(jié)果應(yīng)為陰性。③空白對(duì)照，用免去特異性抗體或用PBS替代特異性抗體，結(jié)果應(yīng)為陰性。④抑制試驗(yàn)，將標(biāo)記抗體(例熒光抗體)和未標(biāo)記的抗體或血清等量混合后，按上述步驟處理切片，結(jié)果應(yīng)為陰性（一步法）。或?qū)⒋龣z切片兩張，一張加未標(biāo)記特異性血清，另一張加未標(biāo)記同種正常血清，孵育后沖洗，再加入標(biāo)記的特異性血清（例如特異性熒光標(biāo)記抗體），加了未標(biāo)記特異性血清的切片因抗原抗休已結(jié)合，故染色被抑制，呈陰性結(jié)果，而加同種正常血清的切片則呈陽性反應(yīng)（二步法）。

對(duì)照染色非常重要，開始試驗(yàn)時(shí)應(yīng)做全面對(duì)照，每次試驗(yàn)時(shí)應(yīng)做陽性和陰性對(duì)照。

2．間接法

（1）標(biāo)本處理同直接法。

（2）滴加適當(dāng)稀釋的特異性抗體于標(biāo)本上，置濕盒中，３７℃ ３０～６０分鐘或４℃過夜。

（3）滴加適當(dāng)稀釋的間接熒光抗體，置濕盒中，３７℃ ３０～６０分鐘。

（５）ＰＢＳ洗２次，雙蒸水洗１次。

（６）甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察。

（７）對(duì)照染色：可用空白對(duì)照和陰性對(duì)照等。