一、骨髓瘤細(xì)胞的制備

1．骨髓瘤細(xì)胞特征骨髓瘤細(xì)胞系和免疫動(dòng)物應(yīng)屬同一品系，這樣雜交瘤融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用骨髓瘤細(xì)胞系有：SP一2／0、NS1、X63、Ag8．653等，本章以SP一2／0為例。骨髓瘤細(xì)胞是經(jīng)過(guò)8一氮*(8一azaguanine，8-AG)、5一溴脫氧尿苷(5一brom-2-deoxy uridine，5一BrdU)或6一巰*(6一thioguanine，6一TG)篩選而得到的遺傳基因缺陷型的細(xì)胞系，骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤一*磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine guanine phosphcnbosyl transferase，HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(tlaymidine Kinase，TK)。因此，當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞主要合成途徑被氨基蝶呤(aminopterin)阻斷，由于其缺乏上述兩種酶，從而導(dǎo)致骨髓瘤細(xì)胞在HAT次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶(T)培養(yǎng)系統(tǒng)中的死亡。

    一般在融合前2周就應(yīng)開(kāi)始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，生長(zhǎng)良好的細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察為圓形明亮、排列整齊、形態(tài)完整、濃度適宜(zui大密度不得超過(guò)106個(gè)／ml)。一般擴(kuò)大培養(yǎng)以l：10稀釋傳代．每3～5d傳代一次。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞每3～6個(gè)月應(yīng)用8一AG篩選一次，以除去HGPRT回復(fù)突變的細(xì)胞。

2．骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備方法

1)于融合前36～48h，將骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)(一般按一塊96孔板的融合試驗(yàn)約需2～3瓶100ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)備)。

2)融合當(dāng)天，用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁輕輕吹下，收集于50ml離心管或融合管內(nèi)。

3)1000r／min離心5～10min，棄去上清液。

4)加入30ml不*培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于10ml不*培養(yǎng)基，混勻。

5)取骨髓瘤細(xì)胞懸液，加0．4％臺(tái)盼藍(lán)染液做活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。

二、免疫脾細(xì)胞的制備

    免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)的脾臟中B淋巴母細(xì)胞一漿母細(xì)胞。一般取zui后一次加強(qiáng)免疫3d以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時(shí)B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合的成功率較高。脾細(xì)胞懸液的制備：在無(wú)菌條件下取出脾臟，用不*培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的2倍，細(xì)胞數(shù)為2×lO4左右。

三、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備

    在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過(guò)程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這種被加人的活細(xì)胞稱(chēng)為飼養(yǎng)細(xì)胞。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞等。取與免疫小鼠相同品系的6～10周齡小鼠，頸椎脫臼處死，腹腔內(nèi)無(wú)菌注射10～15ml*培養(yǎng)液，拇指輕揉腹部數(shù)次后慢慢抽回液體，1000r／min離心5～10min．棄上清液。加人HAT培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105／ml，加入96孔板，100gl／孔，放人37℃5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前1～2d制備，一只小鼠可取lO7個(gè)巨噬細(xì)胞。

四、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)

1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞，1000r／min離心5min，棄上清液．用不*培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不*培養(yǎng)液洗滌2次。

2．同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不*培養(yǎng)液洗滌2次。

3．將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：(5～10)的比例混合，加入不*培養(yǎng)液，1200r min離心8min，棄上清液。在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻，置37℃水浴中預(yù)熱。

4．吸取37℃預(yù)熱的PEG(pH 8．O)1ml，緩緩滴人離心管，1min內(nèi)加完。

5．滴加37℃預(yù)熱的不*培養(yǎng)基1ml，lmin內(nèi)加完，然后加*培養(yǎng)基至50ml．終止PEG的作用。

6．1000r／min離心5min，棄去上清液。將沉淀細(xì)胞輕輕懸浮于所需容積的HAT培養(yǎng)基中，接種24孔板或96孔板，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

7．5d后用HAT培養(yǎng)基換出1／2培養(yǎng)基。

8．7～10d后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基，第14d后可用普通*培養(yǎng)基。

9．經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待其長(zhǎng)至7L底面積1／10以上時(shí)吸出上清液供抗體檢測(cè)。