細(xì)胞生長曲線(cell growth cilrve)是測(cè)定細(xì)胞增長數(shù)值和生長繁殖基本規(guī)律常用的簡便方法，是研究細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增殖過程的重要指標(biāo)。常用方法有細(xì)胞計(jì)數(shù)法。它以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)。細(xì)胞生長曲線可用于分析細(xì)胞增殖速度，確定細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存或具體實(shí)驗(yàn)的時(shí)間。細(xì)胞增殖曲線的測(cè)定一般可利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行。

一、細(xì)胞計(jì)數(shù)法

(一)材料

1．待測(cè)細(xì)胞懸液。

2．24孔培養(yǎng)板。

3．消化液：O．25％*和O．0256 EDTA混合消化液。

(二)方法

1．培養(yǎng)細(xì)胞取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)計(jì)數(shù)并記錄接種的細(xì)胞懸液之密度后，在培養(yǎng)板的21個(gè)孔內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細(xì)胞(如果使用培養(yǎng)瓶，則需接種21瓶)。接種時(shí)間記為0h。

2．計(jì)數(shù)細(xì)胞密度從接種時(shí)問起，每隔24h吸棄3孔中培養(yǎng)液，加入消化液，混懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)3孔(瓶)內(nèi)的細(xì)胞密度，求平均值。為提高準(zhǔn)確率，對(duì)每孔(瓶)細(xì)胞可計(jì)數(shù)2～3次。如此操作至第7d結(jié)束。

3．繪制曲線以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，標(biāo)出各點(diǎn)并連成線，即得所培養(yǎng)細(xì)胞的增殖曲線。

(三)結(jié)果分析

    細(xì)胞增殖曲線反映細(xì)胞的生物學(xué)特征，標(biāo)準(zhǔn)的曲線呈近似“S”形。每一代細(xì)胞的生長過程可大致分為潛伏期、對(duì)數(shù)生長期和停滯期。一般在傳代后*天細(xì)胞數(shù)有所減少，經(jīng)過幾天的潛伏適應(yīng)期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，達(dá)到平臺(tái)期后生長穩(wěn)定，zui后到達(dá)衰老。

1．潛伏期是細(xì)胞對(duì)分離和傳代操作所致的損傷的恢復(fù)以及適應(yīng)新生長環(huán)境的過程。原代培養(yǎng)細(xì)胞需要24～96h。，甚至更長時(shí)間才能恢復(fù)增殖。不同細(xì)胞的增殖恢復(fù)所需的時(shí)間不同，如腫瘤細(xì)胞比二倍體細(xì)胞恢復(fù)得快。傳代細(xì)胞的潛伏期一般為6～24h。

2．對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞數(shù)量呈對(duì)數(shù)增長，對(duì)數(shù)生長期一般為3～5d，常以倍增時(shí)間(即生長曲線上細(xì)胞數(shù)量增加一倍的時(shí)間)來表示細(xì)胞生長旺盛情況。細(xì)胞生長倍數(shù)則是指測(cè)定接種時(shí)活細(xì)胞的濃度，經(jīng)一個(gè)生長周期達(dá)到zui大活細(xì)胞濃度的比率。細(xì)胞傳代、指標(biāo)測(cè)試等多在此區(qū)間進(jìn)行。

3．停滯期細(xì)胞不再增殖，生長活動(dòng)停滯。

(四)注意事項(xiàng)

1．培養(yǎng)板各7L內(nèi)細(xì)胞的消化操作過程要一致，以免造成細(xì)胞濃度的明顯差別。

2．計(jì)數(shù)前，應(yīng)盡量使細(xì)胞混懸均勻。每孔內(nèi)加入的細(xì)胞總數(shù)要求一致，加入培養(yǎng)液的量也要一致。

3．細(xì)胞接種數(shù)量應(yīng)適宜。一般接種數(shù)量以7～10d能長滿而不發(fā)生生長抑制為宜。數(shù)量過少將導(dǎo)致細(xì)胞適應(yīng)期延長，數(shù)量過多易使細(xì)胞快速進(jìn)入增殖穩(wěn)定期。

4．細(xì)胞增殖曲線可有20％～30％的誤差，需較反映生長數(shù)值時(shí)，需結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)行分析。

二、WST一8檢測(cè)法

    WST-8是一種新型的水溶性四唑鹽，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成具有高度水溶性的橙黃色甲臌產(chǎn)物，其顏色的深淺和活細(xì)胞的數(shù)量呈正比。含WST一8成分的CCK 8(cell counting kit一8)試劑盒已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性。其檢測(cè)方法簡單介紹如下：

(一)材料

1．待測(cè)細(xì)胞。

2．96孔培養(yǎng)板。

3．10％FBS培養(yǎng)溶液。

4．CCK 8試劑盒。

5．酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

(二)方法

1.96孔板中每孔加入200 μl含10％FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。

2．每隔24h酶聯(lián)免疫儀測(cè)定各組細(xì)胞在450nm波長處的吸光度值，連續(xù)監(jiān)測(cè)7次。

(三)結(jié)果分析

    計(jì)算各個(gè)實(shí)驗(yàn)分組的吸光度值的平均值，設(shè)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

(四)注意事項(xiàng)

    為了獲得更為可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)至少重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。