當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂，一方面由于細(xì)胞密度過(guò)大，細(xì)胞與細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止；另一方面也會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物枯竭和代謝物積累而不利于生長(zhǎng)或發(fā)生中毒。因此需要將培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分離擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的這個(gè)過(guò)程稱為傳代(passage)或者再培養(yǎng)(subculture)。

1)傳代標(biāo)準(zhǔn)

    傳代時(shí)間一般通過(guò)兩個(gè)方面進(jìn)行確定：一是在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)培養(yǎng)液由于pH值下降面呈現(xiàn)黃色時(shí)，表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到zui大密度，需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)；二是觀察細(xì)胞形態(tài)，健隸細(xì)胞形態(tài)飽滿，折光性好，生長(zhǎng)致密時(shí)即可傳代。初代培養(yǎng)的傳代很重要，是建立細(xì)胞系的關(guān)鍵時(shí)期。在傳代時(shí)一般要特別注意以下3點(diǎn)：

①細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面之前，不要急于傳代。

②原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長(zhǎng)，上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞并存的情況很常見(jiàn)。傳代時(shí)不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間，因此要根據(jù)需要，注意觀察及時(shí)進(jìn)行處理，并可根據(jù)不同細(xì)胞對(duì)*的耐受時(shí)間不同而分離和純化所需要的細(xì)胞。另外早期傳代的培養(yǎng)細(xì)胞較已經(jīng)建系的培養(yǎng)消化時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧，盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷。

③傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境有利于細(xì)胞生存和增殖。隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳人新的培養(yǎng)瓶。

    體外培養(yǎng)技術(shù)中所謂的傳“代”概念并不等于細(xì)胞生物學(xué)中“親代細(xì)胞”與“子代細(xì)胞”中“代”的概念。傳代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是分離后再次培養(yǎng)，進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代，傳代數(shù)可以衡量培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡。

    傳代是細(xì)胞分裂造成的結(jié)果，細(xì)胞從一次分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)細(xì)胞周期，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。細(xì)胞周期能準(zhǔn)確表示細(xì)胞增殖速度。兩次細(xì)胞分裂之間的時(shí)間也可以用細(xì)胞世代時(shí)間來(lái)表示，所以細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無(wú)限生長(zhǎng)下去。

    傳代代數(shù)與細(xì)胞的世代數(shù)(增殖代數(shù))并不是同一個(gè)概念。在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，所說(shuō)的“第6代細(xì)胞”指細(xì)胞已經(jīng)傳代6次。以貼壁細(xì)胞為例，每傳代一次，大概要倍增3．6次，細(xì)胞要經(jīng)歷如下生長(zhǎng)過(guò)程：游離期、貼壁期、潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和停止期(平臺(tái)期)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到平臺(tái)期時(shí)，就要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，甚至死亡。

    培養(yǎng)細(xì)胞有密度依賴和接觸抑制的特點(diǎn)，細(xì)胞濃度過(guò)低，不易存活，表現(xiàn)為細(xì)胞在達(dá)到增長(zhǎng)前有較長(zhǎng)的滯留期；細(xì)胞濃度過(guò)高，發(fā)生接觸抑制后生長(zhǎng)遲緩甚至死亡，所以傳代比例通常按l：2～1：4的稀釋度進(jìn)行。傳代后細(xì)胞的接種濃度一般為5×lO5個(gè)／mL。