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實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法介紹

時(shí)間:2016/2/23閱讀:4886
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 實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)常用的器材一般包括玻璃器材、金屬器械、橡膠制品及塑料制品等,每類器材的處理及消毒措施都有不同。嚴(yán)格的消毒滅菌工作極為重要,直接影響著整個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耥樌M(jìn)行。
 
(一)消毒滅菌方法
目前常用的消毒滅菌方法多采用物理方法(如干熱滅菌法、濕熱滅菌法、過濾除菌法、射線殺菌法等)和化學(xué)方法(消毒劑、抗生素)兩大類。
 
1.干熱滅菌法
是利用恒溫干燥箱內(nèi)120ºC~150ºC的高熱,并保持90~120分鐘,殺死細(xì)菌和芽孢,達(dá)到滅菌目的的一種方法。主要適用于不便在壓力蒸汽滅菌器中進(jìn)行滅菌,且不易被高溫?fù)p壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌。用此方法滅菌的物品干燥,易于貯存。酒精燈火焰燒灼滅菌法也是屬于干熱滅菌的方法之一,在進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)工作時(shí),常須利用工作臺(tái)面上的酒精燈火焰對金屬器具及玻璃器皿口緣進(jìn)行補(bǔ)充滅菌。
 
2.濕熱滅菌法
壓力蒸汽濕熱滅菌法是目前zui常用的一種滅菌方法。它利用高壓蒸汽以及在蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力,使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而使微生物死亡。適合于布類工作衣、各種器皿、金屬器械、膠塞、蒸餾水、棉塞、紙和某些培養(yǎng)液的滅菌。高壓蒸汽滅菌器的蒸汽壓力一般調(diào)整為1.0~1.1kg/cm2,維持20~30min即可達(dá)到滅菌效果。
 
3.射線滅菌法
利用紫外線燈進(jìn)行照射滅菌的方法。紫外線是一種低能量的電磁輻射,可以殺滅多種微生物。紫外線的作用機(jī)制是通過對微生物的核酸及蛋白質(zhì)等的破壞作用而使其滅活。適合于實(shí)驗(yàn)室空氣、地面、操作臺(tái)面滅菌。滅菌時(shí)間為30min。用紫外線殺菌時(shí)應(yīng)注意,不能邊照射邊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,因?yàn)樽贤饩€不僅對人體皮膚有傷害,而且對培養(yǎng)物及一些試劑等也會(huì)產(chǎn)生不良影響。
 
4.過濾除菌法
是將液體或氣體通過有微孔的濾膜過濾,使大于濾膜孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留,從而達(dá)到除菌的方法。過濾除菌法大多用于遇熱易發(fā)生分解、變性而失效的試劑、酶液、血清、培養(yǎng)液等。目前,常用微孔濾膜金屬濾器或塑料濾器正壓過濾除菌,或用玻璃細(xì)菌濾器、濾球負(fù)壓過濾除菌。濾膜孔徑應(yīng)在0.22~0.45μm范圍內(nèi)或用更小的細(xì)菌濾膜,溶液通過濾膜后,細(xì)菌和孢子等因大于濾膜孔徑而被阻,并利用濾膜的吸附作用,阻制小于濾膜孔徑的細(xì)菌透過。
 
5.化學(xué)消毒劑消毒法
用于那些不能利用物理方法進(jìn)行滅菌的物品、空氣、工作面、操作者皮膚、某些實(shí)驗(yàn)器皿等。常用的化學(xué)消毒劑包括甲醛、高錳酸鉀、70%~75%乙醇、過氧乙酸、來蘇爾水、0.1%新潔爾滅、環(huán)氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%~75%乙醇、0.1%~0.2%氯化汞、10%次氯酸鈉、飽和漂白劑等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料的滅菌;利用甲醛加高錳酸鉀[(2mL甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]或乙二醇(6mL/m3)等加熱熏蒸法進(jìn)行無菌室和培養(yǎng)室的消毒。在使用時(shí)應(yīng)注意安全,特別是用在皮膚或?qū)嶒?yàn)材料上的消毒劑,須選用合適的藥劑種類、濃度和處理時(shí)間,才能達(dá)到安全和滅菌的目的。
 
6.抗生素抑菌法
主要用于培養(yǎng)液,是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段以及作為微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素和新霉素等。
 
(二)不同種類物品及培養(yǎng)物的消毒滅菌方法
 
1.無菌操作室滅菌
培養(yǎng)材料進(jìn)行培養(yǎng)、觀察或更換培養(yǎng)液時(shí),必須從各方面防止任何污染物進(jìn)入培養(yǎng)液或容器,所以無菌操作室的滅菌是至關(guān)重要的。由于無菌操作室的污染來源主要是空氣中的細(xì)菌和真菌孢子,因此長期停用后的無菌操作室應(yīng)進(jìn)行熏蒸滅菌,熏蒸是用高錳酸鉀+甲醛[(2ml甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]進(jìn)行無菌室的滅菌。經(jīng)常使用的無菌操作室,在每次使用前都應(yīng)進(jìn)行地面衛(wèi)生清潔,并用紫外線燈照射30
min,進(jìn)行空氣滅菌。對超凈工作臺(tái),每次操作前用紫外燈照射30min,然后用70%~75%酒精擦拭。
 
2.培養(yǎng)液滅菌
培養(yǎng)液在制備過程中帶有各種雜菌,分裝后應(yīng)立即滅菌,或在24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序。目前常用過濾除菌法除去培養(yǎng)物操作液和培養(yǎng)液中的細(xì)菌?;?qū)ε囵B(yǎng)液中耐熱組分先進(jìn)行高壓蒸汽滅菌,然后在無菌室加入經(jīng)過過濾除菌的不耐熱溶液,混勻后分裝備用。
 
使用高壓蒸汽滅菌器滅菌時(shí),將分裝好的培養(yǎng)液放入底部有一定量(淹沒加熱管)涼水的高壓蒸汽滅菌器內(nèi),增壓至0.35~0.4kg/cm2時(shí)排凈滅菌器內(nèi)冷空氣,以便使蒸汽能到達(dá)各個(gè)消毒部位,保證消毒滅菌*。然后繼續(xù)加壓加熱,當(dāng)壓力表讀數(shù)達(dá)到1.0~1.1kg/cm2為121ºC,保持15~20 min即可。由于消毒滅菌效果取決于溫度而不是壓力,所以在一定壓力下保持較長的消毒滅菌時(shí)間是必須的。
 
在121ºC的蒸汽溫度下可以很快殺死各種細(xì)菌及高度耐熱的芽孢桿菌,因此許多培養(yǎng)液的消毒滅菌壓力、溫度一般保持在1.0~1.1
kg/cm2、121ºC。消毒滅菌時(shí)間與需要消毒滅菌的培養(yǎng)液量密切相關(guān)(表2-3),時(shí)間不足達(dá)不到滅菌效果,時(shí)間過長培養(yǎng)液內(nèi)的一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞,影響培養(yǎng)液成分。消毒滅菌結(jié)束后,關(guān)閉熱源,只有當(dāng)滅菌器內(nèi)壓力降為零時(shí)才能打開放氣閥,排除剩余蒸汽,取出培養(yǎng)液。不可在壓力較高時(shí)打開放氣閥,引起減壓沸騰,使容器中液體溢出。
 
培養(yǎng)液組成中如含有遇熱易分解的物質(zhì),則需用過濾方法消毒滅菌。首先對培養(yǎng)液中耐熱組分進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后放置在無菌場所,固體培養(yǎng)液在40ºC左右瓊脂即將凝結(jié)前,加入經(jīng)過過濾除菌的不耐熱溶液,混勻后冷卻備用。液體培養(yǎng)液在冷卻到室溫后再加入過濾除菌溶液。過濾除菌時(shí),使用孔徑為0.22~0.45μm或更小的細(xì)菌濾膜。過濾除菌可利用抽濾裝置或注射過濾器進(jìn)行,所用器皿均應(yīng)進(jìn)行高壓消毒滅菌,溫度不應(yīng)超過121ºC。
 
3.玻璃器皿、塑料器皿和器械滅菌
玻璃器皿可進(jìn)行干熱滅菌或高壓蒸汽滅菌,但在蒸汽滅菌后及時(shí)烘干水分。對不能進(jìn)行高壓蒸汽滅菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡,使用前在無菌操作臺(tái)面上晾干的同時(shí),用紫外線重復(fù)殺菌。實(shí)驗(yàn)室還可以用環(huán)氧乙烷滅菌袋對塑料器皿進(jìn)行消毒,消毒后的器皿要充分散氣2~4小時(shí)后才可使用。無菌操作所用的各種器械,一般采用干熱或高壓蒸汽滅菌,或用75%酒精浸泡,然后在無菌操作臺(tái)面上晾干的同時(shí)再用紫外線重復(fù)殺菌;在使用期間可多次對其進(jìn)行酒精燈火焰灼燒滅菌。
 
4.培養(yǎng)材料的消毒滅菌
采自動(dòng)物機(jī)體的實(shí)驗(yàn)材料,攜帶著微生物及雜質(zhì),接種前須進(jìn)行表面消毒滅菌,對內(nèi)部已受微生物侵染的材料應(yīng)予以淘汰。從動(dòng)物機(jī)體采集的某些組織塊,須用消毒劑進(jìn)行浸泡處理,進(jìn)行表面消毒。常用消毒劑有過氧化氫(10~12%,浸泡5~15min)、過氧乙酸(0.05%,浸泡30 s~1min)、酒精(70~75%,浸泡2min)。 

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