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通用PCR試劑盒

本試劑盒適用于各種 RNA制品的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及隨后的PCR擴(kuò)增。它采用M-MLV進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，能夠獲得較長的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。同時，在20ul反轉(zhuǎn)錄體系和50ul PCR反應(yīng)體系中，還可以一次性得到足夠量的PCR產(chǎn)物用于后續(xù)的克隆實驗。本試劑盒中配制的酶均為進(jìn)口的酶。RT酶采用進(jìn)口的M-MLV，所以cDNA更長，基因的信息保留得更完整！反轉(zhuǎn)錄過程中特異的RNase抑制劑可有效降低由于外源RNase污染而導(dǎo)致實驗失敗的風(fēng)險。本試劑盒使用方便、快捷，可廣泛用于cDNA克隆及目的基因檢測等分子生物學(xué)實驗。

通用RT-PCR試劑盒(M-MLV)產(chǎn)品簡介

莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV RT）是一種RNA依賴的DNA聚合酶，能使mRNA（>5kb）轉(zhuǎn)錄為cDNA。M-MLV RT的RNase H活性相對于禽成髓細(xì)胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶較弱，更適合用來反轉(zhuǎn)錄較長的mRNA。M-MLV RT應(yīng)用于以RNA為模板合成cDNA的一條鏈。

注意：M-MLV RT的延伸性要低于AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，因此要得到和用AMV 反轉(zhuǎn)錄酶一樣產(chǎn)量的cDNA需加入更多單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。

通用RT-PCR試劑盒使用方法

1）使用方法簡介以用2mg總RNA為例。在無RNase離心管中，加入0.5mg引物至含總RNA的樣品中，總體積不大于15ml。70℃，5分鐘打開模板鏈形成的二級結(jié)構(gòu)。立即放于冰上降溫防止二級結(jié)構(gòu)恢復(fù)，隨后短暫離心使液體集中在離心管底。

2）加入以下成分到已退火后的引物-模板混合物中。

注意：不要改變引物的加入比率。

通用PCR試劑盒常見問題與解決方法:

常見問題	可能原因	解決方法
陽性對照、待測樣本均無條帶。	PCR反應(yīng)體系或反應(yīng)條件不合適。	使用梯度PCR摸索PCR反應(yīng)條件。
	PCR試劑保存不當(dāng)失去活性。	2× PCR Mix應(yīng)保存于-20℃，使用時避免反復(fù)凍融。若使用頻繁，可在4℃短時間存放。
	引物設(shè)計問題。	嘗試重新設(shè)計引物進(jìn)行檢查。
陽性對照有目的條帶，待測樣本無條帶或條帶弱。	不當(dāng)儲存或長期儲存引起試劑活性喪失。	使用新鮮的試劑。
	加入組織裂解液過量。	增大反應(yīng)體系，或減少裂解液的用量。
	樣本裂解混合液保存不當(dāng)或保存時間過久，DNA基因組已經(jīng)降解。	裂解混合液液可在4℃保存2-3天，盡量使用新制備的裂解液混合液進(jìn)行PCR。
	模板加入量不適合。	在反應(yīng)體系10-20%范圍內(nèi)優(yōu)化模板加入量。反應(yīng)效性能較差時，可以降模板濃度調(diào)節(jié)到低于10%的范圍。
	PCR循環(huán)數(shù)不足。	適當(dāng)增加PCR的循環(huán)數(shù)，推薦在35-40循環(huán)為佳。因為模板復(fù)雜，一般PCR反應(yīng)要比用純化的 DNA模板多5-10個循環(huán)為佳。
非特異性擴(kuò)增	PCR退火溫度太低，循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高。	增加PCR退火溫度，降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度。
	PCR引物錯配。	重新設(shè)計PCR引物。
	配制PCR反應(yīng)體系時溫度太高或配制完成后放置時間太久。	PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進(jìn)行，配制完成后盡快進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
陰性對照出現(xiàn)目的條帶	操作工具或試劑污染。	實驗所有試劑或器材均應(yīng)高壓滅菌。操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。
陰性對照出現(xiàn)目的條帶	樣本間交叉污染。	每個取樣器只對一個樣本使用；或取完一個樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復(fù)涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。