灌胃
1. 準(zhǔn)備藥物和灌胃器械
2. 抓取老鼠
3. 灌胃
注意事項(xiàng)：
1） 抓取老鼠時(shí)，可以戴大手套，但是操作起來會很不方便；建議只戴橡膠手套或不戴手套。左手大拇指
和食指從耳后固定老鼠頭部，將頸部皮膚抓緊，使頭部不能轉(zhuǎn)到（但也不要窒息），剩余手指將老鼠
背部皮膚抓緊，使其身體不能扭動。使其和身體成一直線。可以兩人配合，但是會浪費(fèi)時(shí)間，更增加
灌胃難度；強(qiáng)烈建議一人獨(dú)立操作。
2） 老鼠抓好后，要正確持針，中指、無名指和大拇指夾住針體，食指放在推塞上；針務(wù)必要沿口角進(jìn)入，
大概進(jìn)入針體的2/3 即可將藥物注射入胃，注意進(jìn)針不順時(shí)切忌用力，應(yīng)重新進(jìn)針。如果當(dāng)時(shí)藥物沒
有流出，既可確認(rèn)灌胃成功，如果流出則失敗。
3） 在正式實(shí)驗(yàn)灌胃前，務(wù)必先練習(xí)。首先不要懼怕老鼠，其次不要先老鼠臟（清潔級老鼠很干凈的），
再次，不能生硬，不要讓老鼠緊張。
4） 熟能生巧，邊學(xué)習(xí)邊練習(xí)邊思考方能學(xué)好。

2VO 模型
1. 準(zhǔn)備手術(shù)器械
2. 麻醉
3. 去除頸部毛
4. 切開中正頸部皮膚，分離肌肉、血管、神經(jīng)
5. 分離目標(biāo)血管，雙線結(jié)扎，血管無需剪斷
6. 縫合傷口
注意事項(xiàng)：
1） 縫合線用 4 號線；
2） 麻藥目前本實(shí)驗(yàn)室暫時(shí)使用水合氯醛，一般是10%的，按照350mg/kg 量給藥，由于老鼠對藥物的耐
受差異較大，醉把握不好死亡率較高；麻醉不足時(shí)，補(bǔ)藥不超過前總量的10%，補(bǔ)藥時(shí)非常容易
導(dǎo)致死亡，且等待時(shí)間會明顯延長；麻醉過度則可進(jìn)行口腔插管和輔助呼吸，如果均不行，則死亡
放棄。）
3） 分離血管時(shí)務(wù)必不能將神經(jīng)損傷。
4） 出麻醉狀態(tài)的老鼠體溫調(diào)節(jié)失衡，所以手術(shù)過程中注意保溫；
5） 老鼠體重在 250-280g 左右實(shí)驗(yàn)，死亡率zui低；
6） 打麻藥時(shí)注意：首先正確抓取老鼠（見灌胃操作規(guī)程），再次將老鼠頭朝下倒置成30 度角，右手持
針，腹中線和兩后腿中間連線相交處進(jìn)針，回抽后，注射。此法標(biāo)準(zhǔn)、簡便、快速。
7） 總之，在正式實(shí)驗(yàn)前邊學(xué)習(xí)邊練習(xí)邊思考方能學(xué)好，熟能生巧。有不足之處，敬請各位老師同學(xué)批
評指正，以使該實(shí)驗(yàn)更加臻美。

灌 注
1. 準(zhǔn)備好器械和灌注液；
2. 取老鼠，按照 350mg/kg 水合氯醛麻醉，可適當(dāng)過量；
3. 將老鼠腹腔胸腔打開，分離出心臟；
4. 將針插入左心室，剪破右心耳；
5. 調(diào)節(jié)針頭位置，使水流zui大；
6. 血液顏色明顯變淺后，換甲醛液，抽搐完成后，將水流調(diào)為每秒一滴；
7. 將針頭和心臟固定；固定至少 40min 后取腦；
8. 將取出的大腦放在 4%甲醛液保存。
注意事項(xiàng)：
1） 灌注液用量：0.9%生理鹽水每只350ml~450ml，0.4%甲醛300ml~400ml 之間；生理鹽水適當(dāng)多一
些可以保證血液沖洗*；甲醛固定時(shí)間長些，大腦充分固定，有利于取腦和后續(xù)試驗(yàn)；
2） 進(jìn)針前要保證針頭處沒有氣泡，以免進(jìn)入血管影響灌注；
3） 在抽搐完成前，不要將心臟用夾子夾，而是用手拿，這樣可以保證水流速度和心臟完整；待
抽搐完成后，再夾??；
4） 進(jìn)針時(shí)，不能太猛，以免針頭進(jìn)入右心室內(nèi)，進(jìn)針后，適當(dāng)調(diào)節(jié)，注意不要進(jìn)入左心房；
5） 灌注完成后，將管道沖洗一下，收拾器械；
6） 取腦注意：
*， 將大腦剪下，去除腦后肌肉和椎骨，露出枕骨大孔；
第二， 將頭部皮膚剪開，并將兩側(cè)咬肌剝離；
第三， 然后用大剪刀將枕骨打孔縱向和橫向切開三個口，⊥字型切口；
第四， 用止血鉗將頭骨掀開，注意不要觸到大腦；
第五， 頭蓋骨掀開后，小心將腦膜剝離；
第六， 將附著咬肌的兩塊骨頭可適當(dāng)掀開；（此步可以省略）
第七， 如果力氣足夠，可以一手將老鼠頭握緊，另一手用力擊打手腕，直接將大腦震抖出來，
這樣可以保證大腦完整，且節(jié)省時(shí)間；強(qiáng)烈建議此方法，女生基本都能抖出來。如果不
行再進(jìn)行第五步或第七步操作；
第八， 如果力氣不夠，則慢慢取出：1，小心將后腦掀開，剪斷腦下鏈接的神經(jīng)，2，看大腦可
以自由活動時(shí)，再用力抖，可將大腦抖出，注意不要甩到地上；3，若不能抖出，再小心
將前面的神經(jīng)鏈接剪斷即可出來。不過此方法很容易將大腦損傷，切浪費(fèi)時(shí)間，對技術(shù)
要求很高，建議盡量不要用方法。
7） 總之，在正式實(shí)驗(yàn)前邊學(xué)習(xí)邊練習(xí)邊思考方能學(xué)好，熟能生巧。

切 片
1. 將在甲醛中固定的大腦先浸泡到 20%的蔗糖，使其沉下去，再轉(zhuǎn)到30%的蔗糖，使其沉下，才能進(jìn)
行切片；
2. 提前一天預(yù)約使用冰凍切片機(jī)；
3. 取浸泡好的大腦，根據(jù)切片所需部位，對大腦進(jìn)行修整，使其底端平整，易于放在載物釘上；
4. 取載物釘放入切片機(jī)箱冷凍后，用 OCT 或PBS 制作平臺，平臺厚度大約3mm，將其面修平整；
5. 將修平整的大腦放到載物釘上，用 PBS 固定，大約10-15min，后可進(jìn)行切片，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要對大腦
進(jìn)行再修正；
6. 切片厚度根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需，適當(dāng)調(diào)整，一般腦片為 35-40?m；
7. 一般切 5 張片子取一次，但更要根據(jù)實(shí)際情況??；
注意：
1） 蔗糖沉下去的標(biāo)準(zhǔn)是，震蕩后仍能很快沉下；
2） 其他切片注意事項(xiàng)，見切片機(jī)上的注意事項(xiàng)；
3） 總之，在正式實(shí)驗(yàn)前邊學(xué)習(xí)邊練習(xí)邊思考方能學(xué)好，熟能生巧。有不足之處，敬請各位老師同學(xué)批評
指正，以使該實(shí)驗(yàn)更加臻美。

染 色
HE 染色
丙酮固定 1-2min
水洗 5s
蘇木精染色 4-5min
水洗5s
分化液 7-8s
水洗
伊紅 20-30s
水洗
Nissl 染色
氯仿 5min
丙酮 15min
100%酒精 30s
95%酒精 30s
70%酒精 30s
蒸餾水過 2 次
焦油紫染色液 20min
水過 3 次
70%酒精 60s
95%酒精 60s
100%酒精 90s
氯仿 5min
分化劑（拿進(jìn)去即出來）
95%酒精過一下
100%酒精過一下
100%酒精過一下
二甲苯 透明 1min 2min 3min 三次
附錄：焦油紫染色配方：1%焦油紫溶液中加冰醋酸，ph=3.75-3.85
尼氏分化劑：于95%乙醇中滴加冰醋酸 ph=4.1，此pH 很難調(diào)，有文獻(xiàn)記載1~3 滴冰醋酸。
H&E 分化液：0.3%氫氧化銨（氨水），或者1%鹽酸酒精（70%酒精99ml+1ml 鹽酸）。
注意：
1） 染色時(shí)間和沖洗時(shí)間要根據(jù)片子的厚度，適當(dāng)調(diào)整染色時(shí)間和沖洗時(shí)間；
2） 很多染液有揮發(fā)性和毒性，實(shí)驗(yàn)時(shí)注意保護(hù)自己，在柜子中操作；
3） 染色前晾干標(biāo)準(zhǔn)是，片子周邊泛白；
4） 總之，在正式實(shí)驗(yàn)前邊學(xué)習(xí)邊練習(xí)邊思考方能學(xué)好，熟能生巧。