WB成功與否的關(guān)鍵
嚴(yán)重影響WB實驗結(jié)果的關(guān)鍵點有：蛋白提取，制備凝膠，電轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，化學(xué)發(fā)光，曝光時間。基本上任何一步實驗做不好都會影響它的結(jié)果，所以很多人都說WB難做就是這個原因。

首先說說蛋白提取，找一個好的細(xì)胞裂解液是做好WBzuizui重要的一步，提不好蛋白一切都是白搭。網(wǎng)上有許多的配方，大家可以慢慢去試找到一個合適自己的。

然后是凝膠的配置，這個主要是要注意目的蛋白分子量的大小要和你所配置的分離膠濃度相對應(yīng)，大分子量的蛋白就要配置低濃度的膠，小分子的蛋白就要配置高濃度的膠。zui后把pH值調(diào)準(zhǔn)，不使用凝膠邊緣的孔道。PS：制膠板肯定是要洗干凈的。

電轉(zhuǎn)膜的時候，注意小分子蛋白和大分子蛋白的轉(zhuǎn)膜是有區(qū)別的（濕轉(zhuǎn)）：
大分子與小分子蛋白的轉(zhuǎn)膜
    大分子蛋白質(zhì)（＞100KDa）
1.大分子蛋白跑的十分的慢，所以要確定分離膠的濃度不要大于8%，同時轉(zhuǎn)膜的時間還要適當(dāng)?shù)难娱L；
2.大分子蛋白質(zhì)很容易在凝膠里沉淀，阻礙轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入SDS可以阻止大分子蛋白質(zhì)沉淀，但甲醇會把SDS從蛋白質(zhì)中脫離下來，所以降低轉(zhuǎn)膜緩沖液中甲醇的含量有利于大分子蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜；
小分子蛋白質(zhì)（＜100KDa）
1.SDS會阻礙所有的蛋白質(zhì)結(jié)合到膜上，而小分子蛋白質(zhì)所受到的影響會比大分子蛋白質(zhì)大，所以如果目的蛋白的分子量比較小的話，要考慮把SDS從轉(zhuǎn)膜緩沖液中移除；
2.保持轉(zhuǎn)膜緩沖液中甲醇的濃度在20%左右。
除了這個還要注意轉(zhuǎn)膜的電流和時間，我是轉(zhuǎn)恒流300mA，小于100KDa的轉(zhuǎn)1.5小時以內(nèi)就夠了。當(dāng)然膜，膠與濾紙之間要沒有氣泡啦！

封閉，要注意時間稍微長一點會更好，多于2個小時是個不錯的建議，室溫下孵育就可以了。要注意的是做磷酸化目的蛋白的時候不能用脫脂牛奶封閉，要用BSA。

一抗孵育和二抗孵育，強(qiáng)烈建議使用好的抗體（特別是剛做WB實驗的同仁們）。抗體出現(xiàn)問題影響結(jié)果是比較少出現(xiàn)的。一抗孵育一般建議使用1：1000的抗體稀釋比例，室溫孵育1.5小時。二抗孵育建議使用1：6000的抗體稀釋比例，室溫孵育1.5小時。（補(bǔ)充一點，我配置的膠的厚度是0.75毫米的薄膠，上樣量是每個孔道20微克總蛋白）

zui后是化學(xué)發(fā)光，這個主要注意就是選一個比較好試劑就行了。

曝光時間是各人選擇合適的時間就可以了，主要是要注意所得的條帶不要顯得太粗就可以了。